ICS65.020.30 B 41 SC 中华人民共和国水产行业标准 SC/T 7234—2020 白斑综合征病毒（WSSV）环介导等温 扩增检测方法 Detection method by loop-mediated isothermal amplification for white spot syndrome virus 2020-08-26 发布 2021-01-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 SC/T 7234—2020 业食品标准 共服 公共 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 典通 本标准由农业农村部渔业渔政管理局提出。 本标准由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156)归口。 本标准起草单位：中国水产科学研究院黄海水产研究所。 本标准主要起草人：黄健、张庆利、邱亮、徐婷婷、桑松文、万晓媛、梁艳、杨冰、李晨。 1 SC/T7234—2020 白斑综合征病毒（WSSV）环介导等温扩增检测方法 1范围 本标准给出了白斑综合征病毒（WSSV)环介导等温扩增检测所需试剂和材料、器材和设备、操作步骤 和结果判定的要求 本标准适用于白斑综合征病毒的初筛检测 2 规范性引用文件 PUBL 仅注日期的版本适用于本文件。 NN 凡是不注日期的引用文 GB/T28630.2 白斑综 检测法 3缩略语 下列缩略语 活用 Bst酶：Bst 热启动 DNA聚合厂 dNTP：脱 LAMP:环 等温 WSSV:白 Y 4试剂和材料 4.1 除非另有说 在分 相尚 度的水。 4.2引物： WSSV-F3.5 200 WSSV-B3:5 保有 DCG WSSV-FIP:5 TTTTGCC AC ATC TGT G3', 20μmol/L，一20℃保 WSSV-BIP:5'-AAA TAGAA CGC AAG AAA CTG CCT T-3'，20μmol/L，一20℃保 4.310×IsothermalAmplificationBuffer：商品化产品，稀释为1×工作液时内含20mmol/LTris-HCl， 50mmol/LKCl,10mmol/L(NHzSO, imol/LMgSo Tween?20，或其他等效等温扩增缓 冲液。 4.4dNTP（各20mmol/L）：含dATP、dTTP、dCTP、dGTP各20mmol/L，按附录A中A.1的规定执 行，一20℃保存，避免反复冻融。 4.5甜菜碱（Betaine)：浓度5mol/L，按A.2的规定执行，一20℃保存，避免反复冻融 4.6 硫酸镁（MgSO,）：浓度100mmol/L，一20℃保存。 4.7 BstDNA聚合酶：浓度8U/uL，一20℃保存。 4.8 核酸染料：20XEvaGreen，商品化试剂，4℃保存，或使用其他等效试剂。 4.9 阳性对照为已知感染WSSV且PCR结果显示明显阳性的对虾组织，一20℃保存。 4.10 阴性对照为已知未感染WSSV且PCR结果显示阴性的对虾组织，一20℃保存。 4.11 空白对照为灭菌的去离子水。 SC/T7234—2020 5器材和设备 5.1微量移液器。 5.2离心机。 5.3手掌型离心机。 5.4普通冰箱。 5.5 一20℃低温冰箱。 5.6涡旋振荡器。 5.7实时荧光定量PCR仪。 6操作步骤 6.1样品准备 样品准备按GB/T28630.2—2012中6.2的规定执行。 6.2样品核酸提取及变性 6.2.1样品核酸提取按GB/T28630.2一2012中6.3的规定执行，也可采用等同效果的商品化试剂盒。 6.2.2核酸提取完成后稀释为150ng/μL~200ng/μL,取10μL分装于0.2ml.PCR管中在95℃条件 下保温5min，然后迅速冰浴。 6.3LAMP检测 6.3.1反应体系配制 按表1的要求配制LAMP检测反应体系，混匀后，分装为24μL/管；同时设置空白对照、阴性对照和 阳性对照。加样需按空白对照、阴性对照、待检样品、阳性对照的次序分别加入1μL、总量为10ng100ng 的模板。待检样品DNA制备见6.2。反应体系配制须在冰盒上进行，务必使试剂及反应混合物在操作时 处于低温状态。 表1LAMP反应预混物所需试剂 试剂 加样量，μL 试剂终浓度 10X Isothermal Amplification Buffer 2. 5 1X MgSO,(100 mmol/L) 1. 0 4.0mmol/L Betaine (5 mol/L) 6. 0 1. 2 mol/L dNTP（各20mmol/L) 1. 75 1.4mmol/L WSSV-FIP(20μmol/L) 2. 0 1. 6 μmol/L, WSSV-BIP(20μmol/L) 2. 0 1. 6 μmol/ L WSSV-F3 (10 μmol/L) 0. 5 0. 2 μmol/L WSSV-B3 (10 μmol/L) 0. 5 0.2μmol/L BstDNA聚合酶（8U/μL) 1. 0 0.32U/μL Eva Green (25 μmol/L) 0. 8 0. 8 μmol/L 水 5.95 反应体系配制也可采用同等效果的商业化LAMP试剂盒代替。 注：扩增靶序列参见附录B，推荐实验室分区和污染控制措施见附录C。 6.3.2反应条件 各样品置于实时荧光定量PCR仪中，选择SYBR通道，65℃反应60min。 7结果判定 7.1阳性对照反应产生典型“S"形扩增曲线且空白对照和阴性对照无S"形扩增曲线时，实验结果有效， 可以进行检测结果判定。 2 SC/T 7234—2020 7.2 2若待检样品反应产生典型“S"形扩增曲线，则判定该样品为WSSV阳性， 7.3 3 SC/T 7234—2020 附录。 A （规范性附录） 检测相关试剂配方 A. 1 dNTP(各 20 mmol/L) 商品化试剂含dATP、dTTP、dCTP和dGTP各1管，每管400uL.浓度为100mmol/L。化冻后，将 上述dATP、dTTP、dCTP和dGTP混合 B 中，一20℃保存，避免反复冻融 A. 2 甜菜碱（5mol/L 称取2.93g甜菜碱 末 mL，混勾并分装至多个 1.5mLEP管中， SC/T 7234—2020 附录 B （资料性附录） WSSVLAMP检测方法引物设计及其在靶基因中的位置 LAMP引物在WSSV靶基因中的位置见图B.1。 WSSV-F3 primer F3 5' -AAATAGACCATGTTATCGCACTAGATGCATCATTCTTAACTGAAAATGGAGCATATGTATTCCCTGAAGACGGAGGACCCAAATCCAAAT 55077 WSSV-FIP primer F2 5' -ATAACCCCTACGCACCAATCTGTCCAACAAAAGATGCTGCTCAAGGAGAATCTCGATCTTCCGCAACATTCCACCACCCGCATTCTCTAT 55167 WSSV-Blc adaptor Flc WSSV-Flcadaptor 5' -TGCCTTGCGTCGCAACCATGAAAGATTTCCCTAAAGCACAATCCCTCTCCTGCGATAAACGCATGTCCACTTTAAACGCAGTTTCTTCCC 55257 3' -ACCGAACCCACCCTTCCTACTTTCTAAACGGATTTCCTATTAGCGACAGGACGGTATTTCCCTACAGGTGAAATTCCGTCAAAGAAGCC WSSVBIP primer 55347 3'-AAGAAAACAGGTATCCTTTCCTACAACGTCTCCCATAAAAACTCCAACGTCTCCTGCCGCACCACCCCAACCGCTCCTTCCGTTAAAGTC B2 B3 WSSV-B3 primer 图B.1LAMP引物在WSSV靶基因中的位置 注：该序列的GenBank号为AF369029；其中WSSV-FIP由F1c+F2组成，WSSV-BIP由Blc+B2组成（KONOetal.， 2004)。 5