ICS 65.020.30 B 41 SC 中华人民共和国水产行业标准 SC/T 72332020 急性肝胰腺坏死病诊断规程 Code of diagnosis for acute hepatopancreatic necrosis disease 2020-08-26发布 2021-01-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 SC/T7233—2020 前业 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由农业农村部渔业渔政管理局提出 本标准由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156)归口。 本标准起草单位：中国水产科学研究院黄海水产研究所 本标准主要起草人：万晓媛、杨冰、黄健、张庆利、谢国驷、王海亮、梁艳、李晨、刘莉、董宣。 I SC/T7233—2020 急性肝胰腺坏死病诊断规程 1范围 本标准给出了急性肝胰腺坏死病诊断（acutehepatopancreaticnecrosisdisease，AHPND）的术语和 定义、缩略语、试剂和材料、器材和设备、临床症状，规定了采样、组织病理学检测、分子生物学检测、菌种鉴 定和综合判定。 本标准适用于致急性肝胰腺坏死病副溶血性弧菌（AHPND-causingVibrioparahaemolyticus， VPAHPND)引起的对虾急性肝胰腺坏死病流行病学调查 诊断和监测 2规范性引用文件 ARD 下列文件对于 不可少 凡是不注日期的引用文 件,其最亲 舌所有的修改单 GB 4789.7 食品安全国家标准 食品微生物学检验 副溶血性弧 GB/T286 2012 百斑综合征（WSD）诊断规程 部分套 202 GB/T 28 白斑综合征（WSD）诊断规程 4部分组织 SC/T70 水生动生 疾病术语与命名规则 RA 3术语和定义 SC/T7011 界定的 倍和 4缩略语 下列缩略语 用手 bp:碱基对 i Ct值：阅值 value) DAFA：戴维森 n-a acid fixative) DNA：脱氧核糖 dNTPs:脱氧核糖 三磷酸 onus PCR：聚合酶链式反应（polymeras Fchainreact Pirtoxin：杀昆虫发光杆菌同源的毒素（P otorhabdusin ect-relate oxin) qPCR：实时荧光定量PCR itativereal-timepolymerase reaction) SPF：无特定病原体（specificpathogenfr Taq酶：水生栖热菌DNA聚合酶（ThermusaquaticusDNApolymerase) VAHPND：致急性肝胰腺坏死病弧菌（AHPND-causingVibriospp.） 5试剂和材料 5.1 除非另有说明，标准中使用的水为蒸馏水、去离子水或相当纯度的水。 5.2二甲苯：分析纯。 5.3中性树胶。 5.4DAFA固定液：见附录A中的A.1。 5.5苏木精染色液：见A.2。 5.61%伊红储存液：见A.3。 SC/T7233—2020 5.71%焰红储存液：见A.4。 5.8伊红-焰红染色液：见A.5。 5.9粘片剂：见A.6。 5.1095%乙醇：分析纯。 5.1185%乙醇：见A.7。 5.1280%乙醇：见A.8。 5.1375%乙醇：见A.9。 5.1470%乙醇：见A.10。 5.1550%乙醇：见A.11。 5. 16 组织病理学检测阳性对照为受VpAHPND感染且显示明显病理变化的对虾肝胰腺组织切片。 5. 17 组织病理学检测阴性对照为未受VpAHPND感染的健康对虾肝胰腺组织切片。 5. 18 dNTPs(各 2. 5 mmol/L),含 dATP、dTTP、dGTP、dCTP 各 2. 5 mmol/L 的混合物,-20℃ 保存。 5.1910XPCR缓冲液,无Mg2+,-20℃保存。 5. 20 MgCl2 (25 mmol/L),-20℃保存。 5. 21 Taq 酶(5 U/μL),-20℃保存。 5.22分子生物学检测阳性对照为已知受VpAHPND感染的对虾肝胰腺组织DNA，或VpAHPND菌液DNA， 或含有pirAP、pirB基因的质粒DNA，一20℃以下保存。 5.23分子生物学检测阴性对照为SPF对虾组织DNA，一20℃以下保存。 5. 24 分子生物学检测空白对照为灭菌双蒸水。 5. 25 50×电泳缓冲液：见A.12。 5. 26 1×电泳缓冲液：见A.13。 5. 27 6X载样缓冲液。 5. 28 琼脂糖。 5. 29 DNA分子量标准。 5.30 琼脂糖凝胶电泳核酸染料及其他等效产品。 6器材和设备 6.1切片机。 6.2组织脱水机。 6.3 包埋机。 6.4染色机。 6.5展片水浴锅。 6.6平板烘片机。 6.7显微镜。 6.8 PCR仪。 6.9电泳仪。 6.10水平电泳槽。 6.11紫外观察仪或凝胶成像仪。 6. 12荧光定量PCR仪。 6.13高速离心机。 2 SC/T7233—2020 6.14微量移液器。 7临床症状 患病对虾甲壳发软，空肠空胃或肠道内食物不连续，肝胰腺色浅发白，萎缩变小，表面常见黑色斑点和 条纹，不易用手指捏破。参见附录B。 8采样 8.1采样对象 凡纳滨对虾（Litopenaeusvannamei）和斑节对虾（Penaeusmonodon）等易感品种，优先选择濒死虾或 具有临床症状的对虾。参见附录B。 8.2采样数量、方法和保存运输 应符合GB/T28630.4—2012中附录B的要求。 8.3样品采集 8.3.1组织病理学检测的样本，选取肝胰腺，快速浸人DAFA固定液中固定，24h后换人70%乙醇中长 期保存。 8.3.2分子生物学检测的组织样本，选取肝胰腺、胃、中肠及后肠。亲虾的非致死检测取粪便。所取样品 立即进行DNA提取，或暂存于95%乙醇中，或保存于一20℃。采样时，稍大的虾取个体检测，仔虾或未达 到0.5g的样品可合并样本。 8.3.3对于细菌分离的样品，用无菌牙签从肝胰腺或胃部蘸取微量液体，按GB4789.7进行分离和增菌 培养。 9 组织病理学检测 9.1操作方式 使用6.1~6.6中设备或手动操作完成。 9.2修块 样品切片前的取材修整，应符合GB/T28630.4一2012中附录B的要求，保证病灶部位能被有效地 切片。 9.3脱水 75%乙醇(1h45min)→85%乙醇(1h45min)→>85%乙醇(1h45min)-→95%乙醇(45min)-→>95% 乙醇（45min）→无水乙醇（45min）→无水乙醇（45min）。 9.4透明 无水乙醇：二甲苯（1：1)（25min）→二甲苯（20min）→二甲苯（20min）。 9.5浸蜡 纯石蜡（1h20min)→纯石蜡（1h20min）。 9.6包埋 9.7切片 厚度5μm。对每个石蜡包埋块至少切取2片不连续的切片。 9.8展片 宜40℃展片，用涂有一层粘片剂的载玻片捞出，置于平板烘片机上于45℃烘片2h。 9.9染色 二甲苯（5min）→二甲苯（5min）→无水乙醇（2min）→无水乙醇（2min）→95%乙醇（2min）→95% 乙醇（2min）-→80%乙醇（2min）-→80%乙醇（2min）-→50%乙醇（2min）-→蒸馏水（2min）→蒸馏水 （2min)→蒸馏水（2min）→苏木精染色液（5min）→缓慢流动的自来水（6min）→伊红-焰红染色液 3 SC/T 7233—2020 (2min)→95%乙醇(1min20s)→95%乙醇（2min）→无水乙醇（2min)→无水乙醇（2min)→二甲苯 (2min30 s)→二甲苯(2min30 s)→二甲苯(2min30 s)。 9.10封片 滴加2滴中性树胶封片。 9.11观察 显微镜下观察。 9. 12 病理诊断 急性感染期，可见虾肝胰腺小管从近端到末端大量的、渐进性变性，部分细胞核膨大，伴随明显的上皮 细胞圆化和脱落，细胞脱落至肝胰腺管腔、收集管及后胃。感染末期，可见明显的小管间血细胞浸润和大 量的继发性细菌感染，与肝胰腺小管细胞坏死和脱落联合发生。判定为疑似VpAHPND感染。急性肝胰腺 坏死病组织病理学图例，参见附录C P 10分子生物学检测 10.1DNA提取 10.1.1 对于组织 便样品， ~50 mg,按 GB/T 28 提取总DNA。 10.1.2对于菌落培养的细菌样品， 取 emL 养菌液置 mE 中 8000r/min离心 5min，尽量弃掉 清液加 1ml灭菌双蒸水清洗 次后离色 沉淀加 菌文 仅蒸水充分混匀， 00 r/min 离心5mh将上清液转移至新管备用 SEARC 煮沸10min， 10.2 DNA A提取质量监控 10.2.1按 GB 2012中6.4的规 足目生物组织样品的 NA提取质量。 监控 10.2.2以细菌 16SrR 细菌样的 ONA提取 工 10.3 套式 PCR 检测 C 10. 3. 1食 第 PCR体系配制 m 按照表1中弓 物序列酉 制第 R反应体务 PCR 的样品DNA，同 时设立阳性对照、阴性对照和 PCR反应体系，包括10XPC R缓冲液 无Mg2+）2.5μL、 MgCl2 (25 mmol) 01/L2L号物AP4F1(10 5μL、引物AP4-R1 (10 μmol/L)0. 5 μ aq酶( DNA（浓度为50 0g/μL)1μL、灭菌双蒸 水15. 2 μL。 套式 扩增基因 引物名利 开物序列（5-3 产物片段大小 AP4-F1