ICS 65.020.30 B 41 SC 中华人民共和国水产行业标准 SC/T 7232-2020 虾肝肠胞虫病诊断规程 Code of diagnosis for Enterocytozoon hepatopenaei disease 2020-08-26发布 2021-01-01实施 中华人民共和国农业农村部 5发布 SC/T7232—2020 前 通 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由农业农村部渔业渔政管理局提出， 本标准由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156)归口。 本标准起草单位：天津市水生动物疫病预防控制中心、中国水产科学研究院黄海水产研究所 本标准主要起草人：耿绪云、刘群、王菁、韩进刚、赵良炜、徐赞霞、梁艳。 I SC/T7232—2020 虾肝肠胞虫病诊断规程 1范围 本标准给出了虾肝肠胞虫病（Enterocytozoonhepatopenaeidisease)诊断试剂和材料、器材和设备、临 床症状，规定了采样、组织病理、套式PCR和TaqMan荧光定量PCR等病原检验的3种方法和综合判定 本标准适用于虾肝肠胞虫病的诊断、监测、检疫和流行病 2 规范性引用文件 适用争本齐 凡是不注日期的引用文 分组织 GB/T28630.4 2012 之斑综 病理学诊断法 SN/T1193 基因检验实验 3缩略语 用手孕 下列缩略语适 bp：碱基 ase pair DNA:脱 兑氧核糖核酸 EB：溴化 Z 定（ahid mbromid EHP：虾肝 为胞虫（E eroc nhebat PCR:聚 链反应 SWP:孢 壁蛋白（ SSUrRM 小亚单位核糖体核糖核酸 CSma Taq：水生栖 us Tris:三羟甲 4试剂和材料 4.1 除非另有说明，在分 析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或 去离 相当纯度的水。 4.2组织病理法所用试剂和材料：除阳性对照、阴性对照外，按照GB/T28 -2012中第3章的规定 执行。 4.3无水乙醇：分析纯。 4.410XPCR缓冲液：随TaqDNA聚合酶提供，一20℃保存 4.5MgCl²(25mmol/L):一20℃保存。 4.6dNTPs（各2.5mmol/L）：含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各2.5mmol/L的混合物，一20℃保存，用 于PCR。 4.7TaqDNA聚合酶(5U/μL)：-20℃保存。 4.82×预混液(2XPremixExTaq)。 4.9套式PCR引物的目的基因为SWP基因，对虾肝肠胞虫有很高的特异性，浓度为10μmol/L。序列 如下： 514F:5'-TTG-CAG-AGT-GTT-GTT-AAG-GGT-TT-3'; 514R:5'-CAC-GAT-GTG-TCT-TTG-CAA-TTT-TC-3'; 147F:5'-TTG-GCG-GCA-CAA-TTC-TCA-AAC-A-3'; 1 SC/T7232—2020 147R:5'-GCT-GTT-TGT-CTC-CAA-CTG-TAT-TTG-A-3。 4.10TaqMan荧光定量PCR引物和探针的目的基因为SSUrRNA基因,对肠胞虫属有较好的特异性， 但对虾肝肠胞虫的特异性不高，浓度为10μmol/L。序列如下： 157F:5'-AGT-AAA-CTA-TGC-CGA-CAA-3'; 157R:5'-AAT-TAA-GCA-GCA-CAA-TCC-3° TaqMan探针:5'-FAM-TCC-TGG-TAG-TGT-CCT-TCC-GT-TAMRA-3。 4.11矿物油：要求无DNA酶和RNA酶，用于无热盖的PCR扩增仪，还可以降低气溶胶产生的风险。 4.12分子量标准：DL2000Marker。 4.13琼脂糖。 4.14抽提液I：按附录A中A.2的规定执行。 4.15抽提液Ⅱ：按A.3的规定执行。 4.16TE缓冲液：按A.4的规定执行。 4.171×TAE电泳缓冲液：按A.8的规定执行。 4.18核酸凝胶染色剂：10mg/mL溴化乙锭(EB)储存液按A.10的规定，或其他EB替代品。 4.19组织病理阳性对照：受EHP感染的对虾制成的组织切片。 4.20组织病理阴性对照：未受EHP感染的对虾制成的组织切片。 4.21套式PCR和TaqMan荧光定量PCR阳性对照：为已知EHP阳性的组织样品DNA模板，满足 PCR分析需要，一20℃保存。 4.22套式PCR和TaqMan荧光定量PCR阴性对照：为已知EHP阴性的组织样品DNA模板，一20℃ 保存。 4. 23 套式PCR和 TaqMan 荧光定量 PCR空白对照为无菌双蒸水。 5器材和设备 5.1组织病理法所用器材和设备：按照GB/T28630.4—2012中第4章的规定执行。 5.2PCR扩增仪。 5.3实时荧光定量PCR仪。 5.4核酸浓度测定仪。 5.5电泳仪。 5.6水平电泳槽。 5.7紫外观察仪或凝胶成像仪。 5.8普通台式高速离心机。 5.9手掌型离心机。 5.10水浴锅或金属浴。 5.11普通冰箱。 5.12加热设备：电炉或微波炉等。 000000 μL。 5.14分析天平：可精确称量到0.0001g的天平。 6 临床症状 患病对虾肝胰腺和肠道颜色较深，严重者肝胰腺萎缩，生长缓慢，个体明显偏小，感染群体生长差异明 显增大。在正常养殖条件下，摄食正常，肠胃充满食物，不出现大量、急性死亡。体长相同时，发病群体的 2 SC/T 7232—2020 平均体重约为EHP阴性群体的70%（参见附录B)。 7采样 7.1采样对象 ponicus)等对虾，参见附录B。轮虫、卤虫等容易携带EHP的饵料生物。 7.2采样数量、方法和保存运输 应符合GB/T28630.4—2012中附录B的要求。 7.3样品的采集 7.3.1对虾受精卵、幼体、仔虾取完整个体；幼虾至成虾阶段取去除眼柄的头胸部（肝胰腺、鳃丝、心脏 等）、肠组织或粪便。 7.3.2受精卵、幼体、仔虾或达到0.5g样品可以合并样本，个体稍大的虾可取个体进行检验。轮虫、卤 虫取完整个体，可以合并样本进行检验。进行荧光定量PCR检验时，需要对样本进行称重；采集的粪便干 燥后称重。所取样品分别置于1.5mL离心管中，立即进行DNA提取操作或于一20℃暂时保存。 8病原检验 8.1组织病理 8.1.1检验方法 按照GB/T28630.4一2012中第5章的规定执行。选取肝胰腺和肠道进行组织病理检验。 8.1.2结果判定 8.1.2.1正常样品的肝胰腺或肠道组织切片经H-E染色后，核质反差明显，肝胰腺小管和肠道上皮细胞 质染成紫红色，细胞核大而呈椭圆形或圆形，染色质和核仁明显，染成蓝紫色， 8.1.2.2虾肝肠胞虫主要寄生在虾的肝胰腺和肠道组织中。 8.1.2.3被感染的对虾肝胰腺小管上皮细胞胞质内有孢囊，高倍油镜下少量细胞可见嗜碱性胞质包涵 体，并可见密集的大小在1μm左右的粒状孢子。 8.2DNA提取 8.2.1样品DNA的提取应在样品区独立完成，避免造成区域间污染。 8.2.2称取100mg组织样品，放人1.5mL的离心管中，再加人900μLCTAB（见附录A中的A.1,用 前加统基乙醇至终浓度0.25%）并混匀。25℃作用2h。 8.2.3上述混合溶液加人抽提液I（见A.2)500μL，用力振摇30s。12000r/min离心5min，分离两 相。吸取上层水相800μL置于灭菌1.5mL离心管中。 8.2.4再加人抽提液Ⅱ（见A.3)700μL，用力振摇30s。12000r/min离心5min，分离两相。吸取上层 水相600μL置于灭菌1.5mL离心管中。 8.2.5再加入无水乙醇（一20℃预冷）900μL（1.5倍体积），颠倒混匀。一20℃过夜沉淀。12000r/min 离心30min。弃上清液，待干燥后加TE缓冲液（见A.4)100μL溶解作为PCR模板。 8.2.6除CTAB提取方法外，可使用达到同等效果的其他方法或商业化提取试剂盒。 8.2.7采用荧光定量PCR法进行检验时，需以样品的DNA模板量或组织量作为基数进行样品的拷贝 数对比。前者需要对提取的DNA进行浓度及纯度测定；后者应考虑样品提取中的回收率，按上述方法进 行提取时，模板DNA样品中的相对组织量可按如下方法计算：100mg/1000μL×800μL/800μL×600 μL/100μL=0.6mg/μL 8.3套式PCR 8.3.1扩增区域 样品的PCR扩增应在PCR反应区独立完成，避免造成区域间污染。 3 SC/T7232—2020 8.3.2套式PCR第一步 8.3.2.1PCR反应体系（25μL)包括：514F引物（10μmol/L)和514R引物（10μmol/L)各0.5μL,0.5 μL dNTPs (各 2. 5 mmol/L),1. 5 μL MgCl² (25 mmol/L),2. 5 μL 10X PCR Buffer,0. 5 U Taq DNA 聚 合酶，模板基因组DNA1uL，最后用水定容至25μL。PCR反应体系中的dNTPs、MgCl和PCRBuffer 等除模板以外的PCR体系组分应预先配制大样本量的预混物，以消除样品间的体系配制误差，增加体系 配置精度，降低配制工作量。也可用等效的商品化预混Taq酶来代替。每管加20μL矿物油。PCR反应 同时设置空白对照、阴性对照和阳性对照。 4℃保温。 8. 3. 3 套式 PCR 第二步 8.3.3. 1 PCR反应体系(25 5.μL)包括:147F