ICS 65.020.30 B 50 SC 中华人民共和国水产行业标准 SC/T 7230—2019 贝类包纳米虫病诊断规程 Code of diagnosis for bonamiosis of mollusks 2019-08-01发布 2019-11-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 SC/T 7230—2019 前 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由农业农村部渔业渔政管理局提出。 本标准由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156)归口。 本标准起草单位：中国水产科学研究院黄海水产研究所、全国水产技术推广总站、深圳海关。 本标准主要起草人：杨冰、白昌明、刘莹、黄健、王崇明、李清、万晓媛、史成银、李晨、辛鲁生、余卫忠 I SC/T 7230—2019 贝类包纳米虫病诊断规程 1范围 本标准给出了贝类包纳米虫病(bonamiosis)诊断所需试剂和材料、器材和设备，规定了采样、PCR检 测和综合判定的要求。 本标准适用于贝类样品中牡蛎包纳米虫（Bonamiaostreae）和杀蛎包纳米虫（Bonamiaeritiosa）感染 的流行病学调查、诊断、检疫和监测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。 SC/T7205.1牡蛎包纳米虫病诊断规程第1部分：组织印片的细胞学诊断法 SC/T7205.2牡蛎包纳米虫病诊断规程第2部分：组织病理学诊断法 SC/T7205.3牡蛎包纳米虫病诊断规程第3部分：透射电镜诊断法 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 bp：碱基对(basepair) DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid） dNTPs：脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleosidetriphosphate) EB:溴化乙啶(ethidium bromide) EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid) PCR：聚合酶链式反应(polymerase chain reaction） SDS:十二烷基硫酸(sodium dodecyl sulfate) Taq：水生栖热菌（Thermus aquaticus） TE:Tris 盐酸和EDTA缓冲液(EDTA Tris·HCI) Tris：三羟甲基氨基甲烷(tris hydroxymethyl aminomethane) 4试剂和材料 4.1除非另有说明，标准中使用的水为蒸馏水、去离子水或相当纯度的水。 4.2无水乙醇：分析纯。 4.3TE缓冲液按附录A中A.1的规定执行。 4.4抽提缓冲液按附录A.2的规定执行。 4.5蛋白酶K按附录A.3的规定执行。 4.610mol/L乙酸铵按附录A.4的规定执行。 4.7Tirs饱和酚(pH≥7.8)：分析纯。 4.8酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）：分析纯。 4.9氯仿/异戊醇（24：1）：分析纯。 4.101×电泳缓冲液按附录A.5的规定执行。 4.1170%乙醇按附录A.6的规定执行。 4.12dNTP（各2.5mmol/L)：生化试剂，含dATP、dTTP、dGTP、dCTP各2.5mmol/L的混合物， 1 SC/T 7230—2019 一20℃保存，用于PCR。 4.1310XPCR缓冲液：生化试剂，无Mg2+离子，随TagDNA聚合酶提供，一20℃保存。 4.14MgClz（25mmol/L）：生化试剂，一20℃保存。 4. 15 TaqDNA聚合酶（5U/μL）：生化试剂，一20℃保存。 4. 16 正向引物Bo（10μmol/L)：5'-CAT-TTA-ATT-GGT-CGG-GCC-GC-3'，一20℃保存。 4. 17 反向引物Boas（10μmol/L）：5'-CTG-ATC-GTC-TTC-GAT-CCC-CC-3'，一20℃保存。 4. 18 阳性对照：已知受牡蛎包纳米虫或杀蛎包纳米虫感染的贝类组织样品，一70℃保存。 4. 19 阴性对照：已知未受牡蛎包纳米虫或杀蛎包纳米虫感染的贝类组织样品，一70℃保存。 4.20 PCR检测空白对照为灭菌双蒸水。 4.21 琼脂糖。 4.22 DNA分子量标准。 PUBL 4.23 5器材和设备 Q 5.1 PCR仪。 5.2电泳仪。 5.3水平电泳槽。 5.4紫外观察仪或凝胶成像仪 RA 5.5高速冷冻离心机 5.6水浴锅或金属浴 5.7普通冰箱。 5.8 一80℃超低温冰 5.9电炉或微波炉 5. 10 微量移液器：量 20m 6 采样 RI 6.1采样对象 牡蛎等易感双壳贝类 贝类包纳米虫病特征参见附录B： 6.2采样数量、方法和保存运输 应符合SC/T7205.1的要 6.3样品的采集 稚贝（附着后至2mm）和幼贝（2mm )取内脏团；成贝 3.cm）取闭壳肌和消化腺。 样品采集后分别置于1.5mL离心管中，立即进行DNA提取操作或暂时保存于一20℃的冰箱中。 7PCR检测 7.1DNA的提取 7.1.1取30mg～50mg组织样品，加人抽提缓冲液500μL，充分研磨，37℃温浴1h。提取过程中同时 设置阳性对照、阴性对照和空白对照。 7.1.2加入2.5μL20mg/mL蛋白酶K，至终浓度100μg/mL，混匀后置于50℃水浴3h，不时旋动。 7.1.3将溶液冷却至室温，加入等体积平衡酚，颠倒混合10min，于10000r/min离心3min分离两相。 7.1.4水相移至新1.5mL离心管中，加人等体积酚/氯仿/异戊醇（25：24：1)，颠倒混合10min，于 10000r/min离心1min分离两相。 2 SC/T 7230—2019 7.1.5水相移至一新1.5mL离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇（24：1），颠倒混合10min，于 10000r/min离心1min分离两相。 7.1.6水相移至一新1.5mL离心管中，加人100μL10mol/L乙酸铵，混匀后，再加人2倍体积预冷无 水乙醇（一20℃）混匀，一20℃放置2h。10000r/min离心10min，弃上清液。 7.1.8加人100μL灭菌双蒸水溶解DNA。 7.1.10可以采用同等抽提效果的其他方法或使用商品化DNA抽提试剂盒。 7.2PCR扩增 7.2.1PCR反应体系：按照表1的要求，加人除TaqDNA聚合酶以外的各项试剂，配制成大体积的预混 物，分装保存于一20℃的冰箱中。临用前，加人相应体积的TagDNA聚合酶，混匀，按1个反应体系/支 分装到0.2mLPCR管中。分别加人各样品的模板DNA(浓度：50ng/μL～100ng/μL)1μL，同时设阳性 对照、阴性对照和空白对照。 表1PCR反应预混物所需试剂和组成 试剂 25μL体系 试剂终浓度 10×PCR缓冲液 2. 5 μL 1×PCR缓冲液 MgClz (25 mmol/L) 2. 5 μl. 2. 5 mmol/ 1. dNTPs (各 2. 5 mmol/lL.) 2. 0 μL, 200 μmol/L 引物 Bo (10 μmol/L) 1. 0 μL 0. 4 μmol/ L 引物 Boas (10 μmol/L) 1. 0 μL 0. 4 μmol/ L 灭菌双蒸水 14. 7 μL TaqDNA聚合酶(5U/uL) 0. 3 μL 1. 5 U 注：25μl体系模板量1μl。 7.2.2将上述加有DNA模板的PCR管按以下程序进行扩增：94℃预变性5min；94℃变性30s、55℃退 火30s、72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸7min，4℃保温。 7.3琼脂糖凝胶电泳及测序 7.3.1配制1.5%的琼脂糖凝胶，加入10mg/mLEB至终浓度0.5μg/mL，摇匀，制备琼脂糖凝胶。 7.3.2将5μLPCR反应产物与1μL6×载样缓冲液混匀后加人加样孔中。同时设立DNA分子量标准 对照。 7.3.3在1V/cm～5V/cm的电压下电泳，使DNA由负极向正极移动。当载样缓冲液中溴酚蓝指示剂 的色带迁移至琼脂糖凝胶的1/2～2/3处时停止电泳，将凝胶置于紫外观察仪或凝胶成像仪下观察或拍 照。 7.3.4如果观察到结果阳性，对PCR扩增产物进行测序。 7.4结果判定 7.4.1阳性对照在300bp处有特定条带、阴性对照在300bp处无条带且空白对照不出现任何条带，实 验有效。 7.4.2检测样品在300bp处有条带，测序结果同参考序列（参见附录C)进行比较，若序列中存在HaeII 和BglI酶切位点，可判断待测样品为牡蛎包纳米虫PCR结果阳性，若序列中只存在HaeII的酶切位点， 则判断待测样品为杀蛎包纳米虫PCR结果阳性。 8综合判定 8.1对已知贝类包纳米虫病流行区域的易感宿主(参见附录B)样本，按SC/T7205.1组织印片的细胞学 方法或SC/T7205.2中组织病理学方法规定检测结果呈阳性，且PCR检测结果阳性，则确诊为贝类包纳 3 SC/T7230—2019 米虫病。 8.2对已知贝类包纳米虫病流行区域和易感宿主以外的样本，按SC/T7205.1中组织印片的细胞学方 法或SC/T7205.2中组织病理学方法规定检测结果呈阳性，且PCR和SC/T7205.3中透射电镜检测结 果均为阳性，则确诊为贝类包纳米虫病。 GRI SC/T 7230—2019 附录A (规范性附录） 试剂配方 A.1TE缓冲液(