ICS65.020.30 B 41 SC 中华人民共和国水产行业标准 SC/T 7229—2019 鲤浮肿病诊断规程 Code of diagnosis for carp edema virus disease(CEVD) 2019-08-01发布 2019-11-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 SC/T7229—2019 VD 前 言 尔 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由农业农村部渔业渔政管理局提出。 本标准由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156)归口。 本标准起草单位：全国水产技术推广总站、北京市水产技术推广站。 本标准主要起草人：徐立蒲、余卫忠、张文、曹欢、王静波、王姝、潘勇、张锋、梁艳、王立新、李清。 SC/T7229—2019 鲤浮肿病诊断规程 1范围 本标准给出了鲤浮肿病的缩略语、试剂和材料、仪器和设备及临床症状，规定了采样、核酸检测及综合 判定。 本标准适用于鲤浮肿病的流行病学调查、诊断、监测和检 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件 凡是不注日期的引用 新版R GB/T6682 析实 GB/T18088 出 境动物检 SC/T7103 人 3缩略语 S 下列缩略语违 用于本 CEV:鲤 病c Fodema CEVD: 4 试剂和材料 4.1CEV阳性 质.由 4.2水：符合 668 4.3 无水乙醇 4.4 荧光PCR eremix),f 4.5 套式PCR 昆 业试剂20C保存 4.6环介导等温 友 试 倪存 4.7Bst酶：-20℃保存， 酶浓度 4.8引物：荧光PCR和 PCR引物浓度 no LAMP引物浓 100umol/L，一20℃保存。 4.8.1 荧光PCR引物 上游引物qF1:5'-AGTTTTGTAKATTGTAGCATTTC 下游引物qR1:5'-GATTCCTCAAGGAGTTDCAGTAAA-3'; 探针:5'-FAM-AGAGTTTGTTTCTTGCCATACAAACT-BHQ1-3'; 扩增CEVP4a蛋白基因中76bp的片段。 4.8.2套式PCR引物 4.8.2.1F1和R1扩增CEVP4a蛋白基因中的548bp片段，F2和R2从该片段中再扩增180bp片段。 上游引物F1：5'-GCTGTTGCAACCATTTGAGA-3”； 下游引物R1：5'-TGCAGGTTGCTCCTAATCCT-3°； 上游引物F2：5'-GCTGCTGCACTTTTAGGAGG-3'； 下游引物R2:5'-TGCAAGTTATTTCGATGCCA-3。 4.8.2.2BF和BR扩增CEVP4a蛋白基因中的528bp片段.IF和IR从该片段中再扩增478bp片段。 上游引物BF:5'-ATGGAGTATCCAAAGTACTTAG-3'; 1 SC/T 7229—2019 下游引物BR:5'-CTCTTCACTATTGTGACTTTG-3°; 上游引物IF:5'-GTTATCAATGAAATTTGTGTATTG-3'; 下游引物IR:5'-TAGCAAAGTACTACCTCATCC-3'。 4.8.3LAMP引物 F3: TCCCACAGAATGTAATCTCAA; B3: ACCTCATCCAAATTACGTAGT; BIP: TCAATCTGAATTCCTTTCCAGAACA-CGTTGATACAATTCCAGAGC; LF: TGCTCTAGTTCTAGGATTGT; 扩增CEVP4a蛋白基因片段。 5仪器和设备 5.1组织研磨器。 5.2高压灭菌锅。 5.3普通冰箱。 5.4超低温冰箱。 5.5低温离心机。 5.6生物安全柜。 5.7荧光PCR仪。 5.8 PCR仪。 5.9可控温水浴锅。 6临床症状 发病鱼行动迟缓，有时呈昏睡症状。病鱼的症状包括：烂鳃、眼球凹陷、体表糜烂、出血、皮下组织水 肿、吻端和鳍的基部溃疡等。其中最常见的症状是包括烂鳃在内的鳃丝损害症状。鳃组织在低倍镜观察 显示上皮细胞的过度增殖导致鳃丝肿胀；高倍镜下表现出鳃细胞水肿、重度增生、鳃小片相互融合以及上 皮细胞脱落。参见附录A的A.6。 7采样 按SC/T7103的规定执行。取样数量按GB/T18088的规定执行。体长≤4cm的鱼取整条；带卵黄 囊的鱼去掉卵黄；体长4cm～6cm的鱼苗取鳃及所有内脏；体长大于6cm的鱼则取鳃、肾。 8核酸检测 8.1 DNA 抽提 8.1.1将样品匀浆后按1：10比例添加PBS缓冲液或细胞培养液，冻融1次，1000r/min离心10min 后，取450μL上清液。加人到1.5mL的离心管中。 8.1.2加人450uLCTAB溶液（见附录B的B.1)混匀。25℃处理2h2.5h。 8.1.3加人600ul.抽提液1（见B.2），混合混匀至少30s。12000r/min离心5min，取上层水相（约800 μL)置于新的1.5mL离心管中。 8.1.4加入700uL抽提液2（见B.3），充分混匀至少30s。12000r/min离心5min，取上层水相（约600 μL)置于新的1.5ml离心管中。 8.1.5加人一20℃预冷的1.5倍体积的无水乙醇（约900uL），倒置数次混匀后，一20℃沉淀核酸8h 以上。 2 SC/T 7229—2019 8.1.612000r/min离心30min，小心弃去上清液。干燥5min～10min后加11μLDEPC水溶解，用 作PCR模板。 8.1.7也可采用同等功效的核酸抽提试剂盒。 8.2设立对照 设立阳性对照、阴性对照和空白对照。取已知含有CEV的阳性样品组织作为阳性对照；取CEV检 8.3荧光PCR 8.3.1反应体系 DEPC水至20uL。瞬时离心，将PCR管置于荧光PCR仪。 8.3.2反应条件 95℃2min;95℃5s56℃31s，共40个循环 8.3.3结果判定 阴性对照和空白对照应无Ct值；阳性对照Ct值<35，且出现典型扩增曲线，反应成立。待测样品Ct值 ≤35且出现典型扩增曲线，可判为PCR阳性；若待测样品无Ct值，或无扩增曲线，可判为PCR阴性。待测 样品Ct值>35，应进行一次重复检测。若重复检测后结果相同，可判为PCR阳性；否则判为PCR阴性。 8.4套式PCR 反应体系（50μL）为2×预混合液（2×mastermix）25μL，引物F1、R1各2uL，模板5μL，DEPC水 补至50μL。反应条件为95℃预变性4min，95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环 后72℃再延伸10min。如果第一步PCR后的产物在电泳时看不到特异的DNA带，取5μL产物作模板； 如果第一步PCR后的产物在电泳时能看到特异的DNA带,则需将产物按1：100～1：1000稀释,取5μL 稀释后产物作模板，反应条件同上，加人引物F2、R2进行套式PCR扩增。 8.4.2引物BF/BR和IF/IR分别扩增CEVP4a蛋白基因中528bp和478bp的片段 反应体系（50μL）为2×预混合液（2×mastermix)25μL，引物BF、BR各2μL，模板5μl,DEPC水 补至50μl。反应条件为95℃预变性4min，95℃变性1min，45℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环 后72℃再延伸10min。如果第一步PCR后的产物在电泳时看不到特异的DNA带，取5μL产物作模板； 如果第一步PCR后的产物在电泳时能看到特异的DNA带，则需将产物按1：100～1：1000稀释,取5μL 稀释后产物作模板，反应条件同上，加人引物IF、IR进行套式PCR扩增。 8.4.3琼脂糖电泳 用1×电泳缓冲液（见B.4)配制2%的琼脂糖凝胶（含0.5μg/ml.EB，见B.5，或其他等效商品化试 剂）。将5μL样品和1μL6×上样缓冲液（见B.6)混匀后加人样品孔，在电泳时设立DNA标准分子量作 对照。5V/cm电泳约0.5h，当溴酚蓝到达底部时停止，将凝胶置于凝胶成像仪上观察。 8.4.4测序 取PCR产物进行基因序列测定，将测序结果与GenBank中参考序列(见附录C)进行同源性比对。 8.4.5结果判定 PCR扩增后，阳性对照会出现特异的DNA带，阴性对照和空白对照均没有该条带，反应成立。待测 样品第一步PCR扩增有特异的DNA带(548bp或528bp）,或第二步PCR扩增后有特异的DNA带(180 bp或478bp），并经基因测序确定是CEV的，可判为PCR阳性；未扩增出条带的，或条带大小与特异的 DNA带大小不一致，或经基因测序确定不是CEV的，判为PCR阴性。 8.5LAMP检测 8.5.1反应体系 3 SC/T7229-2019 0. 5 mmol/L钙黄绿素和 10 mmol/L MnCl2),FIP 0. 4 μL,BIP 0. 4 μL, F3 0. 1 μL,B3 0. 1 μL,LF 0. 2 μL,模 板 2μL,DEPC水补至 25μl。 8.5.2反应条件 可控温水浴锅中，63℃恒温反应60min，80℃下恒温反应5min以结束反应。轻轻混匀并在黑色背景 下观察。 8.5.3结果判定 阴性对照及空白对照反应管液体呈橙色，阳性对照反应管液体呈绿色，则反应成立；待测样品反应管 液体呈绿色，则判为核酸阳性；待测样品反应管液体呈橙色，则判为核酸阴性。 9综合判定 9.1可疑判定 养殖的鲤或锦鲤出现临床症状，或CEV核酸阳性时判定为疑似 9.2 2确诊判定 养殖的鲤或锦鲤出现临床症状，荧光PCR、套式PCR、LAMP检测中任意一种方法检测结果阳性，判 定为CEVD