ICS 65.020.30 B 50 SC 中华人民共和国水产行业标准 SC/T 7228—2019 传染性肌坏死病诊断规程 Code of diagnosis for infectious myonecrosis (IMN) 2019-08-01发布 2019-11-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 SC/T7228—2019 前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起章 1V 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由农业农村部渔业渔政管理局提出。 本标准由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156)归口。 本标准主要起草人：万晓媛、杨冰、于力、黄健、余卫忠、史成银、张锋、宋晓玲、李清、张庆利、许华、李 晨、刘莉。 1 SC/T 7228—2019 传染性肌坏死病诊断规程 1范围 本标准给出了传染性肌坏死病（Infectiousmyonecrosis，IMN)诊断所需的试剂和材料、器材和设备、 临床症状，规定了采样、组织病理学检测、套式RT-PCR检测和综合判定。 本标准适用于对虾传染性肌坏死病的流行病学调查、诊断、检疫和监测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T28630.4一2012白斑综合征（WSD)诊断规程第4部分：组织病理学诊断 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 bp:碱基对(basepair) cDNA：互补脱氧核糖核酸（complementaryDNA） DEPC：焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate） DNA：脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid) dNTPs:脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate) EB：溴化乙啶(ethidiumbromide) EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid) IMN：传染性肌坏死病（infectiousmyonecrosis） IMNV：传染性肌坏死病毒（infectious myonecrosisvirus） L()S：淋巴器官球状体（lymphoid organ spheroids) M-MLV:莫洛尼鼠白血病病毒（moloney-murine leukemin virus） PCR：聚合酶链式反应(polymerase chain reaction) PvNV：凡纳滨对虾野田村病毒（Penaeusvannamei nodavirus） RNA：核糖核酸(ribonucleic acid) RT-PCR：逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction） Taq:水生栖热菌（Thermus aquaticus) Tris：三羟甲基氨基甲烷(tris hydroxymethyl aminomethane) 4试剂和材料 4.1除非另有说明，标准中使用的水为蒸馏水、去离子水或相当纯度的水。 4.2二甲苯：分析纯。 4.3中性树胶。 4.4戴维森氏AFA(Davidson's AFA)固定液按附录A中A.1的规定执行。 4.5苏木精染色液按附录A.2的规定执行。 4.61%伊红储存液按附录A.3的规定执行。 4.71%焰红储存液按附录A.4的规定执行。 4.8伊红-焰红染色液按附录A.5的规定执行。 1 SC/T7228—2019 4. 9 黏片剂按附录A.6的规定执行。 4. 10 95%乙醇：分析纯。 4. 11 85%乙醇按附录A.7的规定执行。 4. 12 80%乙醇按附录A.8的规定执行。 4. 13 75%乙醇按附录A.9的规定执行。 4. 14 50%乙醇按附录A.10的规定执行。 4. 15 组织病理学检测阳性对照为受IMNV感染且显示明显病理变化的对虾肌组织切片。 4. 16 组织病理学检测阴性对照为未受IMNT 的正常对虾肌组织切片。 4. 17 DEPC水按附录A.11的规定执行或商品化试剂。 4. 18 TRIzoITM总RNA提取试剂，或其他等效产品 4. 19 氯仿：分析纯。 4. 20 异丙醇：分析纯 4. 21 无水乙醇：分 4.22 无RNA酶 的规定执行 4. 23 RNA酶 (RNSi 成R 4. 24 M-MLV 逆车 4. 25 5XM 逆转录 爱冲液 4. 26 dNTP 20℃保存，用 于逆转录。 4. 27 dNTH ，一20℃保存， 用于PCR。 4. 28 10XF CEN 4.29 MgCl2 mmgl 4.30 Taq DI 4.31 套式RT 外侧弓 4. 32 套式RT AA-GT-3'。 4.33 套式RT-PCR LA-3'。 4.34 套式RT-PCR 引物 Tor GT-CTT-G-3”。 4.35 套式RT-PCR检测阳性对照 套式RT-PCR 果显示阳性的对虾组织样 品，一70℃保存。 4.36 套式RT-PCR检测阴性对照为已知未受IMNV感染且套式 PCR结果显示阴性的对虾组织样 品，一70℃保存。 4.37 7套式RT-PCR检测空白对照为DEPC水。 4.38 50X电泳缓冲液按附录A.13的规定执行。 4.39 1X电泳缓冲液按附录A.14的规定执行。 4. 40 6X载样缓冲液。 4.41 琼脂糖。 4.42 DNA分子量标准。 4. 43 10mg/mLEB储存液按附录A.15的规定执行，或其他等效产品。 5 器材和设备 5. 1 切片机。 2 SC/T 7228—2019 5.2组织脱水机。 5.3包埋机。 5.4染色机。 5.5展片水浴锅。 5.6平板烘片机。 5.7显微镜。 5.8 PCR仪。 5.9电泳仪。 5.10水平电泳槽。 5.11 紫外观察仪或凝胶成像仪。 5.12高速冷冻离心机。 5.13水浴锅或金属浴。 5.14普通冰箱。 5. 15 5一80℃超低温冰箱。 5.16电炉或微波炉。 5. 17 微量移液器:量程 0. 5 μL～10 μL、2 μL～20 μL、20 μL～200 μL、100 μL～1 000 μL。 6临床症状 发病急性期的对虾在横纹肌出现局部至弥散的白色坏死区，尤其是在末端腹节和尾扇，个别虾会在这 些部位出现坏死发红。对虾仅在发病急性期出现行为变化，对虾在严重感染时或在网捕、饲喂、水温或盐 度骤变等应激因素作用后，呈濒死状态并突发高死亡率，可持续数日。严重感染的对虾可能刚在应激前进 食，肠道往往充盈食物。剖检可见配对淋巴器官肥大，是正常大小的3倍～4倍。 7采样 7.1采样对象 食用对虾（Penaeus esculentus）、墨吉明对虾（Fenneropenaeusmerguiensis）和凡纳滨对虾（Litope naeusannamei）等易感对虾。参见附录B。 7.2采样数量、方法和保存运输 应符合GB/T28630.4—2012的要求。 7.3样品的采集 适用于组织病理学检测时的样本，包括肌肉、鳃、心脏和淋巴器官。 适用于套式RT-PCR检测时的样本，包括除虾卵和幼体外的仔虾至成虾阶段。对虾仔虾取完整个 体；幼虾至成虾阶段取肌肉、头胸（鳃、心脏、淋巴器官）、血淋巴。对于亲虾的非致死检测取血淋巴和游泳 样品分别置于1.5mL无RNA酶离心管中，立即进行RNA提取操作或加人相应体积TRIzolTM试剂，暂 时保存于一20℃。 8组织病理学检测 8.1修块 样品固定方法和切片前的取材修整，应符合GB/T28630.4一2012的要求，保证标本的病灶部位能被 有效地切片。 8.2脱水 75%乙醇(1 h 45 min)-→85%乙醇(1 h 45 min)->85%乙醇(1 h 45 min)-→95%乙醇(45 min)→95% 3 SC/T 7228—2019 乙醇(45 min)→无水乙醇（45 min)→无水乙醇（45 min)。 8.3透明 °( )由二( )由二( )(：)由二： 8.4浸蜡 纯石蜡（1h 20min)→纯石蜡(1h20min）。 8.5包埋 用包埋机进行包埋。 8.6切片 用切片机切片，厚度5μm。对每个石蜡包埋块至少切取2块不连续的切片。 8.7展片 展片水浴锅（40℃）中展片，用涂有一层黏片剂的载玻片捞出，置于平板烘片机上于45℃烘片2h。 8.8染色 二甲苯(5 min)→二甲苯(5min)→无水乙醇(2 min)→无水乙醇(2 min)-→95%乙醇(2 min)-→95% 乙醇(2 min)→80%乙醇（2 min)-→80%乙醇(2 min)→50%乙醇(2 min）→蒸馏水（2 min）→蒸馏水 (2min)→蒸馏水（2min）→苏木精染色液（5min）→缓慢流动的自来水（6min）-→伊红-焰红染色液 (2min)→95%乙醇(1min20s）-→95%乙醇（2min)-→无水乙醇(2min）→无水乙醇（2min）→二甲苯 (s )由二+(s )二(s ) 8.9封片 滴加2滴中性树胶封片。 8.10观察 显微镜下观察。 8.11结果判定 8.11.1IMN的病灶主要出现在横纹肌（主要为骨骼肌，包括心肌）、结缔组织、血细胞及淋巴实质 细胞。 8.11.2急性期的患病对虾出现横纹肌纤维特征性的凝固性坏死，肌纤维间有明显水肿。个别患病对虾 呈急性及陈旧病变的混合表现，肌纤维表现为以凝固性坏死至液化性坏死的