ICS 65.020.30 B 41 SC 中华人民共和国水产行业标准 SC/T 7227-2017 传染性造血器官坏死病毒逆转录环介导等 温扩增(RT-LAMP）检测方法 Detection method of reverse transcriptation loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP)for infectious haematopoietic necrosis virus 2017-12-22 发布 2018-06-01实施 中华人民共和国农业部发布 SC/T 7227—2017 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任， 本标准由农业部渔业渔政管理局提出。 本标准由全国水产标准化技术委员会(SAC/TC156)归口。 本标准起草单位：全国水产技术推广总站、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、深圳市检验检 疫科学研究院。 本标准主要起草人：贾鹏、郑晓聪、余卫忠、王津津、李清、刘莹、温智清、何俊强、于力、兰文升、史秀 杰、刘、秦智锋。 I SC/T 7227—2017 传染性造血器官坏死病毒逆转录环介导等 温扩增(RT-LAMP)检测方法 1范围 本标准规定了传染性造血器官坏死病毒逆转录环介导等温扩增检测方法的试剂和材料、器材和设 备、操作步骤、结果判定和防污染措施 本标准适用于传染性造血器官坏死病毒的初检 2 规范性引用文件 RD 下列文件对于本文件的应用是必不可 仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的 引用 文件,具最新版本(包括所有的修改单) GB/T 6682 分析 水规格 验方法 GB/T 1580 传染性造血器官坏死病 GB 19489 实验 生物 安全通用要 GB/T 27 质量控制规范食品分 SC/T 710 水生动物 产地检疫采样技术规范 OIE《水生动物 物疾病诊 断手册》（2016版） UR 3 缩略语 下列缩略语 用于本文件 AMV逆转 nscriptase) Bst酶:Bs A聚 每（大片段 gment DEPC：焦碳酸 乙酯 dNTPs:脱氧核 EDTA:乙二胺四 IHNV:传染性 necros virus, PBS:磷酸盐缓冲溶 phosp RT-LAMP:逆转录环 个导等温扩增 ription loop-media isothermal amplifica- tion) RNA:核糖核酸(ribonucleic 4概述 在IHNV基因组5401bp～5701bp区域设计6条特异引物（参见附录A），在Bst酶的作用下， 65℃恒温扩增30min～60min，即可实现IHNV核酸扩增。反应结束后，加人荧光显色液即可通过颜色 变化判定结果。 5试剂和材料 5.1水：符合GB/T6682中一级水的规格。 5.2IHNV参考株：由农业部指定单位提供。 SC/T 7227—2017 5.375%乙醇:用新开启的无水乙醇(分析纯)和DEPC水(见附录B中的B.1)配制，一20℃预冷。 5.4Trizol试剂,4℃保存。 5.5异丙醇：分析纯试剂，使用前预冷至一20℃。 5. 6 三氯甲烷：分析纯试剂，常温保存。 5.8Bst酶：一20℃保存，酶浓度为8U/μL,避免反复冻融。 5.9甜菜碱：浓度为5mol/L，一20℃保存，避免反复冻融，见B.2。 5. 10 0 1oX ThermoPol 缓冲液:含 0. 2 mol/ L Tris - HCl, 0. 1 mol/ L KCl, 0. 1 mol/ L(NH4)2SO4, 20 mmol/L MgSO4 和0.1% Triton X-100,一20℃保存。 5.11硫酸镁(MgSO):浓度为150mmol/L。 5. 12 2AMV逆转录酶：一20℃保存，避免反复冻融或温度剧烈变化。 5.13磷酸盐缓冲液(PBS):浓度0.01mol/L,pH7.2,常温保存(见B.3)。 5.14显色液：SYBRGreenI（见B.4)或其他等效的显色试剂。 5. 15 5LAMP引物：一20℃保存备用。其序列如下： 正向外引物(F3):5'-GCAATTCTCCTCCAGAGC-3'; 反向外引物(B3）:5'-TGTCGGTCACTCTGAGG-3'; 正向内引物(F1c+F2) :5'- TCTCCTGACTTGGTGAATTCCTCTTCTTCAGATAGAGTTCGTGGA - 3' ; 反向内引物(B1c+B2):5'-GTGTAACACCGTATGCGGACTTATGACTGCCATCAACACG-3'; 正向环引物(LoopF):5'-ATCCTCGATCTGTGAAGTACAAG-3'; 反向环引物(LoopB):5'-CCTTGCCTGGATCAAGATCA-3'。 5.16矿物油:无RNA酶和DNA酶。 5.17阳性对照:IHNV细胞培养物、组织、含有目的片段的核酸。 5. 18 3阴性对照：经过GB/T15805.2验证的不含IHNV的组织或细胞培养物 5. 19 空白对照:DEPC水。 6器材和设备 6.1 分析电子天平。 6.2冷冻高速离心机。 6. 3 恒温金属浴或恒温水浴锅。 6.4行 微量移液器：量程包括0.5μL～10μL;10μL～100μL;100μL～1000μL。 6.5无菌研钵或研磨棒。 6. 6 一20℃普通冰箱。 6.7 无菌剪刀、镊子、1.5mL离心管、PCR管、与微量移液器相匹配的枪头。 6.8 计时器。 6. 9 pH计。 7操作步骤 7.1采样 7.1.1采样对象 IHNV易感鱼类(参见附录C)。 N SC/T 7227—2017 7.1.2采样数量 采样数量应符合SC/T7103的规定。 7.1.3样品采集 鱼卵取卵膜;亲鱼取卵巢液和精液;体长小于 4 cm的鱼苗取整条鱼,若是带卵黄囊的鱼应去掉卵黄 囊;体长 4 cm～6 cm 的鱼取内脏(包括肾);体长大于6 cm的鱼则取脑、肾和脾。优先采集有临床症状 (参见C.3)的鱼。 7.2样品的处理 实验室检测条件应符合GB19489的规定。最多5尾鱼为一个混合样，冰浴条件下，每个混合样至 少取0.5g组织。用无菌手术剪刀将其剪碎并在低温下研磨成糊状,用预冷的磷酸盐缓冲液（见B.3)按 1mL/g比例将研磨后的组织重悬。4℃、8000r/min离心15min,取上清液用于RNA提取。若待检样 品为细胞培养物，可直接用于RNA提取。 7.3设立对照 从RNA抽提起,每步实验均需设置空白对照、阴性对照和阳性对照。 7.4RNA抽提 取200mg研磨后的组织置于无菌的1.5mL离心管中,加600μL Trizol 溶液,剧烈振荡混匀后,室 温放置5min。加200μL氯仿，盖紧盖子，剧烈摇动15s，室温放置3min。4℃、12000r/min离心5 min。吸取上清液置于新的无菌离心管中，加入500μuL预冷的异丙醇，上下翻转混匀，室温放置10min。 4℃、12000r/min离心5min。缓慢弃上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将液体去除。加入1000μL 预冷的75%乙醇缓慢倒转洗涤沉淀。4℃、12000r/min离心10min，弃上清液，将离心管倒置于吸水纸 上，室温干燥沉淀5min～10min,或用枪头将液体吸干。加人20μLDEPC水，4000r/min离心5s，室 温溶解10min。一20℃保存备用。 可采用同等效果的商业化RNA抽提试剂盒代替以上方法。 7.5RT-LAMP扩增 7.5.1反应体系 将引物溶液置于95℃预变性2min后，立即冰浴5min。 冰浴条件下，按表1配制反应体系并加人0.2mLPCR反应管。按空白对照、阴性对照、待测样品、 阳性对照的顺序依次加人模板，瞬时离心，最后加入30μL矿物油。 表 1 IHNV RT-LAMP 反应体系(25 μL) 组 分 加样量,μL 反应体系终浓度 10XThermoPol缓冲液 2. 5 1X 硫酸镁(MgSO,)(150mmol/L) 1 8 mmol/ L 甜菜碱(5mol/L) 4 0.8 mol/ L dNTPs(10 mmol/ L) 4 1. 6 mmol/ L F1c+F2(40 μmol/ L) 1 1. 6 μmol/ L Blc+B2(40 μmol/ L) 1 1. 6 μmol/ L F3(5 μmol/L) 0. 5 0. 1 μmol/ L B3(5 μmol/ L) 0. 5 0. 1 μmol/ L LoopF(20 μmol/ L) 1 0. 8 μmol/ L LoopB(20 μmol/L) 1 0.8 μmol/L Bst酶(8U/μL) 1 0.32U/μL AMV逆转录酶(5U/μL) 0. 5 0. 1 U/μL DEPC水 4. 5 RNA 2. 5 50 ng/ μL 3 SC/T 7227—2017 7.5.2SYBRGreenI荧光染料预添加 将2μL显色液轻轻滴在PCR管盖上。缓慢盖上PCR盖子,以防显色液掉入反应体系中。 7.5.3反应条件 将反应体系置于恒温金属浴或水浴中，65℃反应40min。 7.5.4显色 将PCR管上下颠倒,使显色液和RT-LAMP反应体系充分接触。在黑色背景下观察反应管液体 颜色变化。 可采用同等效果的商业化LAMP试剂盒代替以上方法。 8 结果判定 8.1空白对照和阴性对照反应管液体呈橙色 阳性对照反应管液体呈绿色，说明实验成立。 8.3待检样品反应管液 色,则判定