ICS 65.020.30 B 41 SC 中华人民共和国水产行业标准 SC/T 7226—2017 鲑甲病毒感染诊断规程 Diagnostic protocol for salmonid alphavirus 2017-06-12 发布 2017-10-01实施 中华人民共和国农业部 发布 SC/T 7226—2017 前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由农业部渔业渔政管理局提出。 本标准由全国水产标准化技术委员会(SAC/TC156)归口。 本标准起草单位：东北农业大学、全国水产技术推广总站、中国检验检疫科学研究院、北京出人境检 验检疫局。 本标准主要起草人：刘敏、余卫忠、吕永辉、江育林、张利峰、任彤 SC/T 7226—2017 鲑甲病毒感染诊断规程 1 范围 本标准给出了鲑甲病毒感染的临床症状检查,规定了样品采集及处理、病毒分离、病毒鉴定及结果 的综合判定的方法。 本标准适用于鲑甲病毒感染鲑科鱼类引起的胰脏病和昏睡病的流行病学调查、疾病诊断、检疫和 监测。 规范性引用文件 RD 下列文件对于本文件的应用是必不可 少的。 件。凡是不注日期的引用文件其最新版本(包括月 所有的修改单 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 RESE GB/T 18088 出入境动物检疫采样 SC/T 7103 地检疫采样技术规范 SEARCH 3 缩略语 下列缩略语适用于手本文件。 CHSE 214 ：大鳞大马哈鱼胚胎细胞系（Chinooksalmon embryo cell line CPE:细胞病 与变效应(Cyto DEPC: rocarbonate dNTP:脱氧核糖核苷 三磷酸（deoxyribonucleoside FCS：胎牛 清（Feta RT-PCR: everse trans cript SAV:鲑甲病毒 试剂和材料 人 4. 1 水:应符合GB/ 6682中 级标准水 4. 2 SAV参考株：由农业部指定的动物病原微生物菌(毒 藏机构提 4.3 CHSE-214细胞。 4. 4 Trizol试剂,4℃保存 4.5 M-MLV反转录酶(200U)，一20 保存 4. 6 DNA分子量标准：DL2000。 4.7 溴化乙锭。 4.8 琼脂糖：电泳级。 4. 9 dNTP:10 mmol/L,一20℃保存。 4. 10 TaqDNA聚合酶:5U/μL，一20℃保存。 4. 11 RNA酶抑制剂(40U/μL)，一20℃保存。 4. 12 TBE电泳缓冲液（5倍浓缩液）：配方按附录A中A.1的规定执行。 4.13 引物：用TE缓冲液或无菌去离子水配置成10μmol/L，一20℃保存；扩增大小为516bp。引物序 SC/T 7226—2017 列如下： E2F: 5'- CCG- TTG- CGG- CCA-CAC- TGG- ATG-3 E2R: 5'-CCT- CAT- AGG- TGA- TCG- ACG- GCA- G- 3' 4.14磷酸盐缓冲液(PBS)：0.01mol/L,配方按附录A.2的规定执行。 4.15L-15或EMEM细胞培养液。 4. 16 6胎牛血清。 4.17无水乙醇：分析纯。 4. 18 3普通琼脂糖凝胶DNA电泳6倍上样缓冲液。 5仪器和设备 5.1 高速冷冻离心机：4℃转速12000g以上。 5. 2 一20℃冰箱。 5.3 PCR仪。 5. 5 凝胶成像仪。 5. 6 可控温水浴锅或恒温金属浴。 5.7 微波炉。 5. 8 ：生化培养箱。 5. 9 涡旋振荡器。 5. 10 ）超净台。 5.11组织匀浆器。 5. 12 2倒置显微镜。 6 流行情况与主要临床症状 参见附录B。 7采样 7.1采样对象 鲑、鳟等易感鱼类。 7.2采样水温与数量 应在水温低于18℃进行,采样数量应符合SC/T7103的要求。 7.3样品采集 在渔场收集患病的、死亡的、体弱的和行为不正常的，特别是在网箱底部昏睡不动的鱼：采集心脏、 鳃、胰腺和骨骼肌。对有临床症状的鱼，体长<4cm的鱼苗取整条，带卵黄囊的鱼应去掉卵黄囊；体长 4 cm～6 cm 的鱼苗取所有内脏;体长>6 cm 的鱼取心脏、胰脏、鳃和骨骼肌。对无症状的鱼取心脏、胰 脏和骨骼肌。取样数量按GB/T18088的规定执行。 8病毒分离和鉴定 8.1病毒分离培养 8.1.1样品处理 SAV的分离，每5尾鱼为1个样品，若有症状成鱼每1尾为1个样品。先用组织匀浆器将样品匀 2 SC/T 7226—2017 浆成糊状。再按1：10的最终稀释度重悬于L-15或EMEM培养液中。将样品匀浆后再悬浮于含有 1000IU/mL青霉素和1000μg/mL链霉素的培养液中，于15℃下孵育2h～4h或4℃下孵育6h～ 24 h。7000g离心30min,收集上清液。如果鱼样本来自于确诊感染传染性胰脏坏死病毒的渔场，应先 用传染性胰脏坏死病毒的抗血清在15℃孵育样品至少1h。 8. 1.2病毒分离 8.1.2.1样品接种细胞与培养观察 将CHSE-214细胞传到96孔板，于20℃培养。把1：10稀释过的样品再用培养液10倍稀释成 1：100和1：1000,然后把这三个稀释度的样品接种到生长48h内的长满细胞单层的96孔板中。每 个样品至少接种2孔,每孔的细胞单层接种100μL稀释液。15℃吸附2h～3h后除去接种物,加人含 2% ～5%胎牛血清的 L-15 或 EMEM 细胞培养液。置 量于15℃培养。同时设置2个阳性对照（接种 至少7d。如果接种了被检匀浆上清稀释液的细胞培养孔中出现细胞病变(CPE),应立即进行鉴定。 CPE表现为致密的斑块和空泡状细胞。 后再用 CHSE-214细胞盲传一次 8.1.2.2盲传培养 传代时,将接种了组织匀浆上清稀释液的细胞单层培养物冻融一次 ℃离心5 min,收 培养液 C继续培养至少 8.1.3结果判定 在空白对照细胞正常、阳性对照出现CPE的情况下，样品接种细胞有 E卫现 或再次盲传培养 后出现CPE，均为病毒分 吉果阳性。 CH 无论是否出现CPE 都需要用RT-PCR方法做进 8.2 RT-PCR C 8.2.1RNA提取 将待检的组织悬液或细胞 加 Trizol,用涡旋 振荡器将其混勺匀， 温放 o uL 氯仿，盖紧离心管盖，用力振荡 心管，室温放置 10min。 4℃,12 离心 min 层液 相移人另一管，加人等体积的无水乙 醇 混匀，一20℃放置 2h以上或过夜,4 上清液,沉淀用1 mL75 %乙醇洗 4℃12000g离心 5 min,去上清液,室温干燥 20mir 用DEPC 水洗脱RNA，获得30μL RNA溶液 在提取 RNA时,应 设立阳性和阴性对照样品，按同样的 方法提 取RNA 也可以选择市售商品化 RNA 提取试剂盒,进行 RNA的提取。 8. 2. 2 RT-PCR 扩增 8.2.2.1cDNA合成 取10μLRNA溶液，下游引物E2R2.5μL和2.5μL无菌去离子水使总体积为15μL。75℃水浴 10 min。冰浴5min,离心1 s～2s,依次加人:5倍反转录缓冲液 5.0 μL、dNTP(10 mmol/L)2. 0 μL、 RNA酶抑制剂(40U/μL)0.5μL、M-MLV反转录酶(200U)0.5μL、DEPC水2.0μL,总体积为25μL。 然后42℃水浴1h后，于70℃水浴5min，冰浴30s，获得cDNA溶液，以cDNA作为模板进行PCR反 应，或于一20℃保存。 8.2.2.2DNA 扩增 在8.2.2.1反应管中再继续加人:10倍TaqDNA聚合酶反应缓冲液8μL、dNTP(10mmol/L) 体积为100μL。加完样品后,PCR管在离心机上离心1s～2s,放人PCR仪中,按照反应条件运行。反 3 SC/T 7226—2017 应条件为：95℃预变性15min，94℃变性20s，57℃退火25s，72℃延伸50s，35个循环，最后72℃延伸 10 min。 8.2.3琼脂糖电泳分析 8.2.3.1琼脂糖凝胶的制作 用1XTBE电泳缓冲液配制1.0%的琼脂糖悬液20mL，微波炉加热至溶液完全透明（胶液体积应 少于容器体积的1/4）。待溶液冷却至60℃左右，加人2μL溴化乙锭，摇匀。将凝胶液缓缓倒入设置好 样孔梳的凝胶槽中，待凝胶完全凝固后，小心拔掉样孔梳。 8.2.3.2电泳 将制备好的琼脂糖凝胶连同凝胶槽一起装入水平电泳槽，加样孔应在负极一侧,加人0.5×TBE电 泳缓冲液至没过胶面1mm2mm的深度。将5uLPCR产物与2uL6倍上样缓冲液混匀后加入到加 样孔中。同时至少一个泳道加人5μLDL2000DNA分子量标准液。在90V～120V条件下电泳，当上 样缓冲液中的指示剂色带迁移至琼脂糖凝胶2/3长度时即可停止电泳，将凝胶置于凝胶成像仪上观察。 8.2.4结果判定 照没有该条带,取PCR扩增产物测序，同参考序列(参见附录C)进行比较，序列符合的可判断待测样品 结果为 RT-PCR 阳性。 8.2.4.2无扩增带或扩增带大小不符合预期值为阴性， 9综合判定 9.1疑似病例的判定 易感鱼类出现典型临床症状;或经细胞培养出现 CPE;或经细胞培养不出现 CPE而RT-PCR结果 为阳性的样品。 9. 2 确诊病例判定 无典型临床症状,直接从鱼组织和经细胞培养后RT-PCR检测同时为阳性结果的样品。 4 SC/T 7226—2017 附录A （规范性附录） 试剂及其配制 A.1TBE电泳