ICS 65.020.30 B 41 SC 中华人民共和国水产行业标准 SC/T 7225—2017 草鱼呼肠孤病毒逆转录环介导等温扩增 (RT-LAMP）检测方法 Detection method by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for grass carp reovirus 2017-06-12 发布 2017-10-01实施 中华人民共和国农业部 发布 SC/T 7225—2017 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由农业部渔业渔政管理局提出。 本标准由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156)归口。 本标准起草单位：浙江省淡水水产研究所。 本标准主要起草人：沈锦玉、郝贵杰、潘晓艺、徐洋、袁雪梅、尹文林、姚嘉、蔺凌云。 I SC/T 7225—2017 引言 本文件的发布机构提请注意，声明符合本文件时，可能涉及到6.3中RT-LAMP引物与《草鱼呼肠 孤病毒I型IⅡ型Ⅲ型RT-LAMP可视化检测试剂盒及其检测方法》（专利号：201410683383.7）及《草 鱼呼肠孤病毒I型Ⅱ型Ⅲ型RT-LAMP荧光检测试剂盒及其检测方法》（专利号：201410684920.X)等 相关的专利的使用。 本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。 该专利持有人已向本文件的发布机构保证，他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下， 就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以下 联系方式获得： 专利持有人：浙江省淡水水产研究所 地址：浙江省湖州市吴兴区杭长桥南路999号 请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专 利的责任。 II SC/T 7225—2017 草鱼呼肠孤病毒逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP)检测方法 1 范围 本标准描述了草鱼呼肠孤病毒逆转录环介导等温扩增检测的技术原理，规定了试剂和材料、器材和 设备、操作步骤及结果判定。 本标准适用于草鱼呼肠孤病毒基因I型、Ⅱ型和Ⅲ型的初筛 2 规范性引用文件 PUBI 下列文件对于本文 件。凡是不注日期的引 用文 件,其最新版 件 GB/T 6682 个析 实验室用水 GB/T 1808 人境动物 检疫采 SC/T 7103 地检疫采样 S 3 缩略语 下列缩略 语i 用于本 AMV酶：AN A 录酶（avia ah Bst 酶:Bst N 酶（大片段）BstL ragmen dNTP：脱氧 核荐 side RdRp:草 平肠孤米 se) RNA:核 RT- LAMP malamplifica- tion) 4技术原理 T 分别根据草鱼 孤病毒 RdRp基因序互 见附 设计特异性内引物、 外引物及环状引物各 特异 别靶序 个独立区域利用 Bst 动循环链置换反应，在 RdRp基因序列启动互补链合 合成，形成 DNA混合物 显色液，即可通过颜色变化观察判定 结果。 5试剂和材料 5.1水：应符合GB/T6682中一级水的要求；DEPC水自配（见附录B中B.1)或购买商品化产品。 5.2阳性对照：各基因型病毒阳性组织、细胞培养物或含目的片段的RNA。 5.3RT-LAMP引物:引物分为A、B、C三组,A为基因I型,B为基因ⅡI型,C为基因Ⅲ型,序列参见 附录A。各组引物10倍浓缩液浓度分别为:F3/B32μmol/L、FIP/BIP16μmol/L、LF/LB8μmol/L; 引物浓缩液D为三组引物混合配置，浓度同A、B、C。一20℃保存备用。 5.4Bst酶：一20℃保存，酶浓度为8U/μL，避免反复冻融。 5.5AMV酶：一20℃保存，浓度为5U/μL，避免反复冻融。 5. 610 X ThemoPol 聚合酶缓冲液：一20℃保存,含 0. 2mol/L Tris-HCl、0.1 mol/L KCl、0. 1 mol/L SC/T 7225—2017 (NH4)2SO4,20 mmol/L MgSO4 和 1% Triton X- 100。 5.7硫酸镁溶液（MgSO）：一20℃保存，浓度为100mmol/L。 5.8甜菜碱：浓度为5mol/L，一20℃保存，避免反复冻融（见B.2）。 5.9dNTP:一20℃保存,含 dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10 mmol/L。 5.10 RT-LAMP反应密封液：购买商品化产品，一20℃保存，无RNA酶的矿物油。 5. 11S SYBRGreenI荧光染料溶液：一20℃保存，10000X染料溶液。 5. 12 磷酸盐缓冲液(PBS)：浓度0.01mol/L,pH7.2,常温保存（见B.3)。 5. 13 3Trizol试剂：4℃保存。 5. 14 三氯甲烷：分析纯试剂，常温保存。 5. 15 异丙醇：分析纯试剂，使用前预冷至一20℃。 5. 16 75%乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，使用前预冷至一20℃。 9 器材和设备 6. 1 一20℃普通冰箱。 6.2剪刀、镊子、解剖刀等解剖用具。 6.3无菌研钵或研磨棒。 6.4涡旋振荡器。 6.5微量移液器和吸头。 6.6台式高速冷冻离心机（最高转速15000r/min)和离心管。 6.7恒温金属浴或可控温水浴锅。 6.8计时器。 6.9微波炉。 6.10高压灭菌锅。 7操作步骤 7.1采样 7.1.1采样对象 草鱼、青鱼等易感鱼类。 7.1.2水温和数量 应在养殖水温高于20℃进行，采样数量应符合SC/T7103的要求。 7.1.3样品采集 按GB/T18088的规定执行。对有临床症状的鱼（参见附录C），体长≤4cm的鱼去尾后取整条 (尾)鱼，体长为4cm～6cm(含）的鱼,取脑、内脏，体长>6cm的鱼取脑、肝、肾和脾；对无症状的鱼取 脑、肝、肾和脾。 7.2样品的处理 将样品置于冰冷的无菌研钵中匀浆，再用PBS配成1：10乳悬液，冻融2次～3次；然后，在4℃条 件下，以5000r/min离心10min，取上清液待检；若待检样品为病毒的细胞纯培养物，可直接抽提RNA 检测。 7.3设立对照 每次扩增应设置空白对照、阴性对照和阳性对照。空白对照以DEPC水代替RNA模板；阴性对照 2 SC/T 7225—2017 以不含目的片段的RNA、正常组织或细胞提取物为模板；阳性对照以含目的片段的RNA、含靶病毒的 组织或细胞提取物为模板。 7.4RNA 抽提 7.4.1取7.2中待检样品，用RNA提取试剂盒抽提，或按7.4.2～7.4.5的方法处理。 7.4.2分别取200μL待检样品匀浆上清液，加人1mLTrizol试剂，用枪头吹打10次～20次，室温放 置5min；加人200uL三氯甲烷，涡旋振荡30s混匀，室温放置15min。 7.4.34℃条件下，12000r/min离心10min;取上层水相至一新的EP管中，加等体积异丙醇，上下颠 倒数次混匀，一20℃放置20min。 7.4.44℃条件下，12000r/min离心10min；弃上清液，沉淀用1mL75%乙醇清洗；4℃条件下，8000 r/min离心10min，弃上清液，沉淀室温干燥5min。 胞培养物，同法抽提RNA。 7.5 RT-LAMP 扩增 7.5.1反应体系 草鱼呼肠孤病毒RT-LAMP反应体系于冰上配制，根据表1和样品数N配置反应体系，之后，按 每反应管分装23μL反应液，并各管分别依次加入空白对照、阴性对照、检测样品和阳性对照，加人浓度 为50ng/μL～250ng/μL的RNA模板2.0μL,混匀。 表1逆转录环介导等温扩增反应体系配置(N=样品数） 组分 工作液浓度 加样量，μL 反应体系终浓度 ThermolPol缓冲液 10X 2.5X(N+3) 1X RT-LAMP引物 10× 2.5X(N+3) 1X dNTPs 10mmol/ L 3.5X(N+3) 1. 4 mmol/L 甜菜碱 5 mol/ L 2.0X(N+3) 0. 4 mol/ L 硫酸镁 100 mmol/ L 1.5X(N+3) 6mmol/L（不包括缓冲液中所含Mg2+） 8 U/μL 1.0X(N+3) 0. 32 U/ μL AMV酶 5 U/ μL 0.5X(N+3) 0.1U/μL 水 9.5X(N+3) 检测草鱼呼肠孤病毒时采用引物浓缩液D进行RT-LAMP检测体系配制；对检测为阳性的样品， 需要区分草鱼呼肠孤病毒基因型时，应分别采用引物浓缩液A、引物浓缩液B、引物浓缩液C进行RT- LAMP检测体系配制。 7.5.2反应条件 恒温金属浴或可控温水浴锅中，65℃反应40min。 7.6SYBR Green I荧光染料染色 将SYBRGreenI荧光染料溶液用DEPC水稀释10倍后，分别取1μL加至25μL空白对照、阴性 对照、阳性对照和待检样品LAMP扩增产物中，轻轻混匀并在黑色背景下观察。 8 结果判定 8.1阳性结果判定 采用引物D进行样品扩增（空白对照和阴性对照反应管液体应为橙色，阳性对照反应管液体应为 绿色）,结果参考附录D的RT-LAMP产物检测图进行判定。检测样品反应管液体呈绿色，则判定检 测样品草鱼呼肠孤病毒初筛阳性；检测样品反应管液体呈橙色，则判定检测样品草鱼呼肠孤病毒初筛 阴性。 3 SC/T 7225—2017 8. 2 2病毒基因型判定 病毒基因型按以下方法判定： a) 采用引物浓缩液A配制RT-LAMP检测体系，检测样品结果为阳性的，则判断检测样品草鱼 呼肠孤病毒基因I型初筛阳性；