ICS 65.020.30 B 41 SC 中华人民共和国水产行业标准 SC/T 7224—2017 鲤春病毒血症病毒逆转录环介导等温扩增 (RT-LAMP）检测方法 Detection method by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for spring viraemia of carp virus 2017-06-12 发布 2017-10-01实施 中华人民共和国农业部 发布 SC/T 7224—2017 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由农业部渔业渔政管理局提出。 本标准由全国水产标准化技术委员会(SAC/TC156)归口。 本标准起草单位：全国水产技术推广总站、深圳市检验检疫科学研究院、深圳出入境检验检疫局、暨 南大学食品安全与研究院。 本标准主要起草人：郑晓聪、贾鹏、李清、王津津、余卫忠、何俊强、于力、刘莹、兰文升、史秀杰、刘、 秦智锋、石磊。 I SC/T 7224—2017 鲤春病毒血症病毒逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法 1范围 本标准给出了鲤春病毒血症病毒逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测的技术原理,规定了试 剂和材料、器材和设备、操作步骤及结果判断。 本标准适用于鲤春病毒血症病毒的初筛检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 15805.5鱼类检疫方法第 5部分:鲤春病毒血症病毒(SVCV) GB/T18088出入境动物检疫采样 SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 AMV 酶:AMV 逆转录酶(avian myelobastosis virus reverse transcriptase) Bst 酶:Bst DNA 聚合酶(大片段)[Bst DNA Polymerase(large fragment)] DEPC:焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate) dNTP:脱氧核苷三磷酸(deoxyribonucleoside triphosphate) EDTA:乙二胺四乙酸(ethlenediamine tetraacetic acid) PBS:磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer saline) RT-LAMP:逆转录环介导等温扩增（reverse transcription loop-mediated isothermal amplifica- tion) SVCV:鲤春病毒血症病毒(spring viraemia of carp virus) 4技术原理 本标准根据 SVCV(参见附录 A中A.1)基质蛋白基因,设计了 4条引物(参见附录B)特异性识别 基因组中的6个区域。在AMV酶和链置换Bst酶的作用下，63℃恒温扩增60min，即可实现SVCV核 酸扩增。而后,在扩增反应后加人显色液，即可通过观察颜色变化判定结果。 5试剂和材料 5.1水:符合GB/T6682中一级水的规格。 5.2DEPC水：配制方法见附录C中C.1或购买商品化试剂 5.3磷酸盐缓冲液(PBS)：配制方法见C.2或购买商品化试剂。 5.4Trizol试剂：商品化试剂,4℃保存。 5.5三氯甲烷：分析纯，避光常温保存。 5.6异丙醇：分析纯，使用前预冷至一20℃。 1 SC/T 7224—2017 5.7引物： SVCV - FIP: 5'- CGCTTGTTCCTAGAACCTTTGTAATTTTTCCCTTGAAGACGATGTCAG 3',40μmol/L备用; 3',40μmol/L备用； SVCV-F3:5'-GGATATACAATTGGACACC-3',10 μmol/L 备用; SVCV-B3:5'- ACAACTTCCTTGCACCTT - 3',10 μmol/L 备用。 5.810×ThermoPol缓冲液：商品化产品，内含0.2mol/LTris-HCl、0.1mol/L氯化钾、0.1mol/L 硫酸铵、20 mmol/L硫酸镁、1% Triton X-100。 5. 9 dNTPs:含 dATP、dTTP、dCTP、dTT 10 mmol/ I 5.10甜菜碱：浓度5mol L，配制方法见 5C.3P 5.11 硫酸镁(MgSO4 ：浓度 5. 12 AMV酶：酶浓度5 保存，避免 反复冻融 5. 13 Bst酶：酶浓度8 U/ 避免反复冻融。 T 5. 14 矿物油：要 RNA酶和DNA酶，可购 商品化产品使用等效 5. 15 75%乙醇 :SYBR Green I(配制方法见C.4)或其他等效的显色试剂。 SEARCH 5. 16 显色液 5. 17 阳性对照： 感染了 SVCV的细胞培养物或组织或含有目的片段的核酸 5. 18 阴性对照 GB/T 15805 5验证的 SVCV的组织或细胞培养 5. 19 空白对照 可用！ 水作为空白对照 6 器材和设备 6. 1 移液器： 包括 100 6. 2 冷冻高速离 机转 6. 3 无菌研钵或研 6. 4 涡旋振荡器 6. 5 恒温金属浴或恒温 1水浴锅：（63 10 6. 6 计时器。 6.7 冰箱。 6. 8 无菌剪刀、镊子、离心管、PCR管等耗材 6. 9 消毒设备。 7操作步骤 7.1样品采集 7. 1. 1采样对象 鲤、锦鲤和金鱼等易感鱼类（参见A.2)。 7.1.2采样水温与数量 应在水温13℃～21℃间进行，采样数量应符合SC/T7103的要求。 7.1.3样品采集 按GB/T18088的规定执行。对有临床症状(参见A.3)的鱼，体长≤4cm的鱼苗取整条鱼，体长 2 SC/T 7224—2017 4 cm6 cm 的鱼苗取内脏,体长>6 cm 的鱼取脑、肝、肾、脾;对无症状的鱼取肾、脾、肝和脑组织。成熟 雌鱼还需取卵巢液。 7.2样品处理 将样品置于预冷的无菌研钵中匀浆，然后用预冷的PBS以1：10（m/）重悬，5000g4℃离心 10min,取上清液待检;若待检样品为病毒的细胞培养物,可直接用于核酸提取。 7.3设立对照 设置空白对照、阴性对照和阳性对照。 7.4RNA抽提 分别取200μL待检样品匀浆上清液,加人1mLTrizol试剂,用移液器充分吹打10次～20次,室温 放置5min；加人200μuL三氯甲烷，旋涡振荡30s混匀，室温放置15min；12000g离心10min；取上层水 相至一新的离心管中,加等 体积异丙醇， 放置20min;12000g离心10min; 弃上清液，沉淀用1mL 75%乙醇清魂:80 发，沉淀室温干燥5min；加20μL DEPC水溶解RNA沉淀 存备用。 RNA提取也可采用 等效的商 A提取试齐 7.5 RT-LAMP 扩增 RE 7.5.1反应体系 PCR反管 在 0. 2 ml 中，按表1在冰上配制反应体系，加样宜按空 阳性对照的次 别加入模板，最后加人20uL矿 物油，瞬时离心 也可采用同 效果的商业化LAMP试剂盒代替以上方法 R 表 1SVCV LANIP 加样量， 10× ThermoPol 缓 中液 UEN 硫酸镁溶液(10 甜菜碱(5mol/ dNTPs(10 mmo SVCV-FIP(40 μ /L SVCV-BIP(40 μm 61/ L SVCV- F3(10 μmol) nol/ L SVCV- B3(10 μmol/ μmol/ L AMV逆转录酶(5 U/μL 2. 5U Bst酶(8U/μL) 4U DEPC水 RNA 50ng/μL 7.5.2反应条件 7.6结果观察 在KT-LAMP扩增结束后的反应管中加人2μL显色液,轻轻混匀并在黑色背景下观察。 8结果判断 8.1空白对照和阴性对照反应管液体呈橙色，阳性对照反应管液体呈绿色时结果成立。 8.2待检样品反应管液体呈绿色，则判断该样品SVCV初筛阳性；待检样品反应管液体呈橙色，则可 判断该样品SVCV检测结果为阴性。 3 SC/T 7224—2017 附录A (资料性附录) 鲤春病毒血症病毒(SVCV) A. 1生物学特性 鲤春病毒血症病毒(Spring Viraemia of Carp Virus,SVCV)是单分子负链 RNA病毒,隶属于弹状 病毒科(Rhabdoviridae）鲤春病毒属（Sprivivirus），是引起鲤春病毒血症（Spring Viraemia of Carp， SVC)的病原，常在春季流行于鲤科鱼特别是在鲤鱼中，引起幼鱼和成鱼死亡。 A.2易感鱼类 tichthys nobilis)、草鱼(Ctenopharyngodon idellus)、鲢(Hypophthalmichthys molitrix)、鲫(Carassius auratus）、丁（Tinca）、欧鲶(Silurus glanis)等。 A. 3 临床症状 感染SVCV的鱼类常常聚集在池塘的进水口,呼吸困难、活力下降,并伴有死亡，这是 SVC暴发的 早期信号。病鱼对外界刺激反应迟钝、游动速度逐步下降，发病后病鱼几乎停止游动、身体失去平衡。 有些死于池底，有些在池塘边缘无方向性的游动或无意识漂游。 病鱼体色发黑，眼球突出,腹部膨大,肛门红肿,体表(