ICS 65.020.30 B 41 SC 中华人民共和国水产行业标准 SC/T 7223.4—2017 黏孢子虫病诊断规程 第4部分：吉陶单极虫 Protocols for diagnosis of myxosporidiosis- Part 4: Disease caused by Thelohanellus kitauei 2017-06-12 发布 2017-10-01实施 中华人民共和国农业部发布 SC/T 7223. 4—2017 前言 SC/T7223《黏孢子虫病诊断规程》拟分为如下部分： 第1部分：洪湖碘泡虫； 第2部分：吴李碘泡虫； 第3部分：武汉单极虫； 第4部分：吉陶单极虫。 本部分为SC/T7223的第4部分。 本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本部分由农业部渔业渔政管理局提出。 本部分由全国水产标准化技术委员会(SAC/TC156)归口。 本部分起草单位：中国科学院水生生物研究所。 本部分主要起草人：李文祥、王桂堂、邹红、熊凡、吴山功、李明。 SC/T 7223. 4—2017 黏孢子虫病诊断规程 第4部分：吉陶单极虫 1 范围 本部分给出了鲤(Cyprinus carpio）患吉陶单极虫病的临床症状,规定了吉陶单极虫（Thelohanel- lus kitauei)的采集、固定与标本制作,形态学鉴定和分子检测的方法,以及吉陶单极虫病的综合判定。 2 规范性引用文件 ARD 下列文件对于 不可少的 凡是注日期的引用文 注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其 其最新 版本(包括所有的修改单 适用 GB/T 6682 析实验室 用水规格和试验方法 SC/T 7103 地检疫采样技术规 范 3试剂和材米 3.1水:符合 GB 中 24 的规格 3.2乙醇:分析纟 3.3 Taq酶 20℃保 ，避免反复冻融 3.4dNTPs dLyP 含 3.5上游引物 CJG 下游引物：5 CCA GGACATCTTAGGGCE GA-3' 本对引物抗 增 核糖体 亚 (18SfDNA)的部分序列 3. 6 DNA mark 000 00F 250、100。 3.7 其他试剂见附录 4 仪器和设备 4. 1 解剖盘、剪刀、镊子、解剖针和解刀 4. 2 体视显微镜和带测微标尺的光学 显微镜。 4. 3 盖玻片、载玻片和培养皿。 4. 4 电子天平。 4. 5 普通台式离心机和高速冷冻离心机。 4.6 普通冰箱。 4.7微量移液器。 4.8PCR扩增仪。 4.9离心管和PCR管。 4.10 紫外透射仪或凝胶成像系统。 4.11 水平电泳系统。 SC/T 7223. 4—2017 5 感染对象与临床症状 5.1感染对象 吉陶单极虫感染鲤。 5. 2 临床症状 吉陶单极虫寄生于鲤的肠道内，病鱼在池边独游，行动迟缓，不摄食，鱼体发黑消瘦；腹部稍隆起，肠 道呈结节型膨大,形成瘤状；肠壁变薄,有腹水。 6吉陶单极虫的采集、固定与标本制作 6.1 病鱼采集 观察待检鱼的临床症状和行为,采集具有典型症状的鱼,采样方法、样品数量、样品封存和运输应符 合SC/T7103的规定。 6.2样品的采集 剖开腹部,剪开肠道的膨大处，用镊子取出包囊，置于培养皿中。 6.3样品的固定 用10%中性福尔马林溶液（见A.1)固定黏孢子虫包囊团或孢子，或用100%乙醇保存。 6.4样品的标本制作 片,用于显微镜观察。 7吉陶单极虫的鉴定 7.1吉陶单极虫形态学鉴定 根据显微镜内的测微标尺测量孢子和极囊的大小，吉陶单极虫孢子的形态特征见附录B。成熟孢 μm,宽7.9μm～11.0μm,厚8.3μm～10.6μm;极囊1个,形状与孢子相似,长度约为孢子长的3/5,极 囊长13.0 μm~18.0 μm,宽 6.0 μm～8.5μm;薄膜鞘长 30.0 μm～38.0 μm,宽12.0 μm～17.0μm;极 丝盘成8圈～10圈。 如果孢子的形态特征与上述描述相符,则可判定为疑似吉陶单极虫。 7.2吉陶单极虫分子检测 7.2. 1虫体 DNA的提取 )%00 的离心管中,加入0.5mL裂解缓冲液（见A.6),55℃下过夜。冷却至室温后,加入500μLDNA抽提 缓冲液（见A.7），摇匀，5200g离心10min，收集上清液。然后加人0.1倍体积的乙酸钠缓冲液（见 沉淀2次,弃上清液，空气干燥后溶于40μLTE缓冲液（见A.4)中，一20℃保存备用。 7. 2. 218S rDNA 的 PCR 扩增 在 50 μL的PCR反应体系中,包含模板基因组 DNA10 ng～50 ng、1.5U Taq酶、1.5mmol/L的 MgCl2、0.2mmol/L的dNTPs、上游引物和下游引物各2μmol/L、Taq酶缓冲液5μL。无加热盖的 PCR仪应滴加少许矿物油。 在PCR扩增仪中,95℃预变性5min，再95℃50s-→>56℃50s-→72℃1min,共35个循环；最后 72℃延伸10 min。 PCR扩增时，应设置阴性对照（无虫体DNA模板)和阳性对照（含吉陶单极虫DNA模板）。 2 SC/T 7223. 4—2017 7. 2. 3 PCR产物电泳与测序 取5μLPCR产物,加人1μL溴酚蓝指示剂溶液（见A.10),混匀，用1.0%琼脂糖凝胶（含0.05μL 紫外透射仪下检查是否存在大约1600bp的目的条带。如存在目的条带，则取PCR扩增产物测序,其 序列见附录C。 7.2.4结果判定 将所测定的18S rDNA序列与附录C中的序列进行比对分析,如果相似性在 99.0%及以上者,则 判定为吉陶单极虫。 综合判定 8.1吉陶单极虫的判定 如果黏孢子虫的形态鉴定符合7.1的规定，且分子鉴定符合7.2.4的规定,则判定为吉陶单极虫。 8. 2 2吉陶单极虫病的判定 鲤肠道感染的虫体为吉陶单极虫,且病鱼临床症状符合5.2描述,则诊断为吉陶单极虫病。 3 SC/T 7223. 4—2017 附录A （规范性附录） 试剂及其配制1) A.110%中性福尔马林溶液 10 mL 甲醛溶液,加 90 mL PBS缓冲液(0. 01 mol/L,pH 7. 4)。 A. 2 吉姆萨(Giemsa)染液 RD 将 1. 0 g Giemsa 粉溶于 #箱中 6 mL 甲醇,棕色瓶密封保存。 使用时与等体积的 PBS 爱冲液OH 4混合。 A. 3 3乙酸钠缓 将 40. 8 g CH, 60ml 离子水中,用冰乙酸调 加去离子水定容至 100 mL. RAL A.4TE缓冲液 将 1 ml T1 mol/ L, pH 8. 0)和 0. 2 mL EDTA(0. 5 mol/ L, pH 合，加无菌去离子 水定容至100m 高压灭菌后 A. 5 10%SDS 将10g SDS mL蒸馏水中,68℃助溶,盐酸调 pH至 ，加蒸馏 至 100mL，室温 保存。 ENT R A.6 裂解缓冲液 900μL TE缓冲液 A.7 DNA抽提缓冲液 将 Tris-HCl溶液饱和过的重蒸酚 ：异戊醇以 25:24 的比例混合，密闭避光4℃ 保存。 A. 8 Taq酶缓冲液(10 倍 PCR buffer) 0.5mol/LpH8.8的Tris-HCl、0.5mol/L的氯化钾（KCl)和1%的TritonX-100的混合 溶液。 A.9TAE电泳缓冲液(50倍) 将242.0gTris碱、37.2gNazEDTA·2HzO混合，然后加人800mL的去离子水充分搅拌溶解，再 加入57.1mL的冰乙酸，充分混匀，加去离子水定容至1L,室温保存。 1）本附录所有试剂，除特别注明外，均采用分析纯的试剂。 4 SC/ T 7223. 4—2017 A.10 溴酚蓝指示剂溶液 取溴酚蓝100mg，加双蒸水5mL,在室温下过夜，待溶解后再称取蔗糖25g，加双蒸水溶解后移人 5