ICS 65.020.30 B 41 SC 中华人民共和国水产行业标准 SC/T 7223.3—2017 黏孢子虫病诊断规程 第3部分：武汉单极虫 Protocols for diagnosis of myxosporidiosis- Part 3: Disease caused by Thelohanellus wuhanensis 2017-06-12 发布 2017-10-01实施 中华人民共和国农业部 发布 SC/T 7223. 3—2017 前言 SC/T 7223《黏孢子虫病诊断规程》拟分为如下部分： 第1部分：洪湖碘泡虫； 第2部分：吴李碘泡虫； 第3部分：武汉单极虫； 第4部分：吉陶单极虫。 本部分为SC/T7223的第3部分。 本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由农业部渔业渔政管理局提出。 本部分由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156)归口。 本部分起草单位：中国科学院水生生物研究所。 本部分主要起草人：李文祥、王桂堂、邹红、熊凡、吴山功、李明。 T SC/T 7223. 3—2017 黏孢子虫病诊断规程 第3部分：武汉单极虫 1范围 本部分给出了鲫(Carassius auratus）患武汉单极虫病（又称“肤孢子虫病")的临床症状，规定了武 汉单极虫（Thelohanellus wuhanensis）的采集、固定与标本制作,形态学鉴定和分子检测的方法，以及武 汉单极虫病的综合判定 Tana ING 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用 是必 可少的。 凡是注日期的 引用文 日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件 GB/T 6682 SC/T 7103 水生动 物产地检疫采样技术规范 SEARCH 试剂和材料 A 水：符合GI 682中 级水的规格。 3 3. 2 乙醇：分析 3.3 Taq酶 免反复伤 dATP 3. 4 dNTPs 3.5 上游引物 下游引物 GGACAT AGGGCATCACAGA=3 本对引物扩 糖体小 NA)的部分序列。 增核 8S 3. 6 DNA marke 000.750 00.250、 K 3. 7 其他试剂见附录 4 仪器和设备 4. 1 解剖盘、剪刀、镊子、解部针和解剖刀。 4. 2 体视显微镜和带测微标尺的光学显微镜。 4.3盖玻片、载玻片和培养皿。 4. 4 电子天平。 4.5普通台式离心机和高速冷冻离心机。 4.6普通冰箱。 4.7微量移液器。 4.8PCR扩增仪。 4.9离心管和PCR管。 4.10 紫外透射仪或凝胶成像系统。 1 SC/T 7223. 3—2017 4.11水平电泳系统。 5 感染对象与临床症状 5.1感染对象 武汉单极虫感染鲫。 5. 2 临床症状 武汉单极虫一般寄生于鲫的体表鳞片下组织和鳍条，寄生于鳞片下的危害较大，可导致鱼苗的死 亡。病鱼鳞片被包囊顶起,形成椭圆形凸起。 6武汉单极虫的采集、固定与标本制作 6.1 病鱼采集 观察待检鱼的临床症状和行为，采集具有典型症状的鱼，采样方法、样品数量、样品封存和运输应符 合SC/T7103的规定。 6.2样品的采集 在鳞片隆起处，用镊子取下鳞片，然后将包囊移出，置于培养皿中。 6.3样品的固定 用10%中性福尔马林溶液（见A.1)固定黏孢子虫包囊团或孢子，或用100%乙醇保存。 6.4样品的标本制作 将黏孢子虫样品置于载玻片上，在标本中加一滴水，或者滴加少许吉姆萨溶液（见A.2），盖上盖玻 片，用于显微镜观察。 7武汉单极虫的鉴定 7.1武汉单极虫形态学鉴定 包囊近球形，乳白色，表面有黑色斑点。根据显微镜内的测微标尺测量抱子和极囊的大小，武汉单 极虫孢子的形态特征见附录B。成熟孢子壳面观为梨形,缝面观呈厚梭形,前端略尖，后端钝圆,薄膜鞘 仅包围孢子后部，壳瓣底部有1个～4个“V"形褶皱；孢子长21.0μm～25.0μm，宽12.0μm～15.0μm， 厚10.0μm～12.5μm;极囊1个,近球形,极囊长9.0μm～12.3μm，宽7.0μm～9.7μm;极丝盘成 8圈~10圈。 如果孢子的形态特征与上述描述相符，则可判定为疑似武汉单极虫。 7.2武汉单极虫分子检测 7.2. 1虫体 DNA的提取 将用100%乙醇固定的孢子（有包囊的用清水冲洗，去除表面组织）充分干燥去除乙醇，置于1.5mL 的离心管中,加人0.5mL裂解缓冲液（见A.6),55℃下过夜。冷却至室温后,加人500μLDNA抽提缓 冲液（见A.7），摇匀，5200g离心10min，收集上清液。然后加人0.1倍体积的乙酸钠缓冲液（见A.3） 和2倍上清液体积的一20℃预冷无水乙醇，4℃下10000g离心10min弃上清液，用70%乙醇洗涤沉淀 2次,弃上清液，空气干燥后溶于40μLTE缓冲液（见A.4)中，一20℃保存备用。 7. 2. 218S rDNA 的 PCR 扩增 在50μL的PCR反应体系中,包含模板基因组 DNA 10 ng～50 ng、1.5U Taq酶、1.5mmol/L的 MgCl2、0.2mmol/L的dNTPs、上游引物和下游引物各2 μmol/L、Taq酶缓冲液5μL。无加热盖的 PCR仪应滴加少许矿物油。 在PCR扩增仪中,95℃预变性5min，再95℃50s→56℃50s→72℃1min，共35个循环；最后 72℃延伸10 min。 2 SC/ T 7223. 3—2017 PCR扩增时,应设置阴性对照(无虫体DNA模板)和阳性对照（含武汉单极虫DNA模板)。 7. 2. 3PCR 产物电泳与测序 取5μLPCR产物，加人1μL溴酚蓝指示剂溶液（见A.10),混匀，用1.0%琼脂糖凝胶（含0.05 μL/mLGoldView核酸染料)于TAE缓冲溶液（见A.9）中电泳分离，同时设置DNA分子量标准做参 照,紫外透射仪下检查是否存在大约1600 bp的目的条带。如存在目的条带,则取PCR扩增产物测序 其序列见附录 C。 7.2.4结果判定 将所测定的18SrDNA序列与附录C中的序列进行比对分析,如果相似性在99.0%及以上者，则 判定为武汉单极虫。 8 综合判定 8.1 i 武汉单极虫的判定 如果黏孢子虫的形态鉴定符合7.1,且分子鉴定符合7.2.4,则判定为武汉单极虫 8.2 武汉单极虫病的判定 鲫体表感染的虫体为武汉单极虫，且病鱼临床症状符合5.2描述,则诊断为武汉单极虫病。 3 SC/T 7223. 3—2017 附录A (规范性附录) 试剂及其配制1) A. 1 10%中性福尔马林溶液 10 mL甲醛溶液,加 90 mL PBS缓冲液(0. 01 mol/L，,pH 7.4)。 A.2 吉姆萨(Giemsa)染液 将 1. 0 g Giemsa 粉溶于 66m 文56℃温箱中2h 6 mL 甲醇,棕色瓶密封保存。使 用时与等体积的PBS 混合 A. 3 乙酸钠缓冲液 将 40. 8 g CH3 3Hz0溶于50mL 用冰乙酸调 加去离子水定容至 100 mL. A. 4 4TE缓冲液 将 1 ml Tr mol/ L, pH 8. 0)和 0. 2 mL EDTA(0. 5 mol/L, pH 合，加无菌去离子 水定容至100 高压 m A. 5 10% SDS 溶液 将 10 g SDS 溶甲9 0 mL蒸馏水中,68℃助溶,盐酸调 pH至 ，加蒸馅力 容至100mL，室温 保存。 ENT A.6 裂解缓冲液 900μLTE缓冲液 A.7 DNA抽提缓冲液 将 Tris-HCl 溶液饱和过的重蒸酚： 氯仿 ：异戊醇以 :24 的比例混合，密闭避光4℃ 保存。 A. 8Taq 酶缓冲液(10 倍 PCR buffer) 0.5mol/LpH 8.8的 Tris-HCl、0.5mol/L的氯化钾(KCl)和1%的 TritonX-100的混合 溶液。 A. 9 9TAE电泳缓冲液(50倍） 将242.0gTris碱、37.2gNa2EDTA·2H2O混合，然后加入800mL的去离子水充分搅拌溶解，再 加入57.1mL的冰乙酸,充分混匀,加去离子水定容至1L,室温保存。 1）本附录所有试剂，除特别注明外，均采用分析纯的试剂。 4 SC/ T 7223. 3—2017 A.10 溴酚蓝指示剂溶液 取溴酚蓝100mg,加双蒸水5mL,在室温下过夜,待溶解后再称取蔗糖25g,加双蒸水溶解后移人 溴酚蓝溶液中,摇匀后加双蒸水定容至50mL,加入氢氧化钠(NaOH)溶液1滴,调至蓝色。