ICS 65.020.30 B 41 SC 中华人民共和国水产行业标准 SC/T 7223.2—2017 黏孢子虫病诊断规程 第2部分：吴李碘泡虫 Protocols for diagnosis of myxosporidiosis- Part 2: Disease caused by Myxobolus wulii 2017-06-12 发布 2017-10-01实施 中华人民共和国农业部 发布 SC/T 7223. 2—2017 前 SC/T7223《黏孢子虫病诊断规程》拟分为如下部分： 第1部分：洪湖碘泡虫； 第2部分：吴李碘泡虫； 第3部分：武汉单极虫； 第4部分：吉陶单极虫。 本部分为SC/T7223的第2部分。 本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由农业部渔业渔政管理局提出。 本部分由全国水产标准化技术委员会(SAC/TC156)归口。 本部分起草单位：中国科学院水生生物研究所。 本部分主要起草人：李文祥、王桂堂、邹红、熊凡、吴山功、李明。 I SC/T 7223. 2—2017 黏孢子虫病诊断规程 第2部分：吴李碘泡虫 1范围 本部分给出了鲫(Carassius auratus）患吴李碘泡虫病（又称“腹孢子虫病”)的临床症状，规定了吴 李碘泡虫(Mycobolus wulii)的采集、固定与标本制作,形态学鉴定和分子检测的方法，以及吴李碘泡虫 病的综合判定， PUBL 规范性引用文件 下列文件对 件的应用是必 凡是注日期的 引用文 日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件 ，其最新版本（包括所有的修改 适用于 GB/T 6682 检室用水规格和试验方法 SC/T 7103 水生动 物产地检疫采样技术规范 3 试剂和材料 水：符合 682中 级水的规格 3. 2 乙醇：分析 20℃保 3.3 Taq酶 旺免反复冻 3.4dNTPs LVP 3.5 上游引物： CTG GCGGACGGCTCAGTA -3 下游引物 CCAGGAC GCATCACAGA 2 本对引物扩 基因 A)的部分序列 3.6 DNA marke F000.750 0_250、100 3.7 其他试剂见附录 4仪器和设备 4. 1 解剖盘、剪刀、镊子、解剖针和解 4.2体视显微镜和带测微标尺的光学显微镜。 4.3盖玻片、载玻片和培养血。 4.4电子天平。 4.5普通台式离心机和高速冷冻离心机。 4.6普通冰箱。 4.7微量移液器。 4.8PCR扩增仪 4.9离心管和PCR管。 4.10紫外透射仪或凝胶成像系统。 1 SC/T 7223. 2—2017 4.11水平电泳系统。 5 感染对象与临床症状 5.1感染对象 吴李碘泡虫主要感染鲫，还可感染鲢（Hypophthalmichthysmolitrix）和马口鱼（Opsariichthysbi dens)。 5. 2 临床症状 吴李碘泡虫一般寄生于鲫的鳃和肝胰脏，寄生于肝胰脏的危害较大；患病的鱼厌食，昏睡，身体消 瘦,游动缓慢,直至慢慢死亡;病鱼腹部膨大,肝胰脏显著增大,乳白色;鱼死亡后,肝胰脏溶解。 6吴李碘泡虫的采集、固定与标本制作 6.1 病鱼采集 观察待检鱼的临床症状和行为，采集具有典型症状的鱼，采样方法、样品数量、样品封存和运输应符 合SC/T7103的规定。 6.2样品的采集 剪开腹部,在肝胰脏中取出包囊团,或用吸管吸取脓状物,置于培养皿中。 6.3样品的固定 用10%中性福尔马林溶液（见A.1)固定黏孢子虫包囊团或孢子，或用100%乙醇保存。 6.4样品的标本制作 将黏孢子虫样品置于载玻片上，在标本中加一滴水，或者滴加少许吉姆萨溶液（见A.2），盖上盖玻 片,用于显微镜观察。 7吴李碘泡虫的鉴定 7.1吴李碘泡虫形态学鉴定 根据显微镜内的测微标尺测量孢子和极囊的大小，吴李碘泡虫孢子的形态特征见附录B。成熟孢 子壳面观为梨形,缝面观呈厚梭形,前端略尖，后端钝圆,无薄膜鞘，壳瓣底部有1个～3个“V”形褶皱； 孢子长16.5μm～18.9μm,宽9.1μm～10.8μm,厚7.2μm～9.0μm。极囊2个,呈梨形,几乎等大,极 囊长8.1μm～9.9μm,宽3.4μm～4.0μm,约占孢子长度的1/2;极丝盘成7圈～9圈。 如果孢子的形态特征与上述描述相符，则可判定为疑似吴李碘泡虫。 7.2吴李碘泡虫分子检测 7.2. 1虫体 DNA的提取 将用100%乙醇固定的孢子(有包囊的用清水冲洗，去除表面组织)充分干燥去除乙醇,置于1.5mL 的离心管中，加入0.5mL裂解缓冲液（见A.6），55℃下过夜。冷却至室温后，加入500μLDNA抽提缓 冲液（见A.7），摇匀，5200g离心10min，收集上清液。然后加人0.1倍体积的乙酸钠缓冲液（见A.3) 和2倍上清液体积的一20℃预冷无水乙醇，4℃下10000g离心10min弃上清液，用70%乙醇洗涤沉淀 2次，弃上清液，空气干燥后溶于40μLTE缓冲液（见A.4)中，一20℃保存备用。 7. 2. 218S rDNA 的 PCR 扩增 在50μL的PCR反应体系中,包含模板基因组 DNA10 ng～50 ng、1.5U Taq酶、1.5mmol/L的 MgCl2、0.2mmol/L的dNTPs、上游引物和下游引物各2μmol/L、Taq酶缓冲液5μL。无加热盖的 PCR仪应滴加少许矿物油。 在PCR扩增仪中,95℃预变性5min，再95℃50s→56℃50s→72℃1min，共35个循环；最后 72℃延伸10 min。 2 SC/T 7223. 2—2017 PCR扩增时,应设置阴性对照(无虫体DNA模板)和阳性对照(含吴李碘泡虫DNA模板)。 7. 2. 3PCR 产物电泳与测序 取5μLPCR产物,加人1μL溴酚蓝指示剂溶液（见A.10),混匀,用1.0%琼脂糖凝胶（含0.05 μL/mLGoldView核酸染料)于TAE缓冲溶液（见A.9)中电泳分离，同时设置DNA分子量标准做参 照，紫外透射仪下检查是否存在大约1600bp的目的条带。如存在目的条带，则取PCR扩增产物测序， 其序列见附录 C。 7.2.4结果判定 将所测定的18S rDNA序列与附录C中的序列进行比对分析,如果相似性在 99.0%及以上者,则 判定为吴李碘泡虫。 8 综合判定 8.1 吴李碘泡虫的判定 如果黏孢子虫的形态鉴定符合7.1的要求,且分子鉴定符合7.2.4的要求,则判定为吴李碘泡虫 8. 2 吴李碘泡虫病的判定 鲫肝胰脏感染的虫体为吴李碘泡虫，且病鱼临床症状符合5.2描述,则诊断为吴李碘泡虫病。 3 SC/T 7223. 2—2017 附录A (规范性附录) 试剂及其配制1) A.110%中性福尔马林溶液 10 mL甲醛溶液,加 90 mL PBS 缓冲液(0. 01 mol/L, , pH 7. 4) 。 A. 2 吉姆萨(Giemsa)染液 RD 66m甘油,放于56 温箱中 6 mL 甲醇,棕色瓶密封保存。 将 1. 0 g Giemsa 粉溶于 66 16.40混合 A. 3 乙酸钠缓冲液 离子水中,用冰乙酸调p 加去离子水定容至 3H20溶于 150mL去 100 mL。 A.4TE缓冲液 pH8.0)和 0. 2 mL EDTA(0. 5 mol/ L, pH 合,加无菌去离子 将 1 ml T mol/L 水定容至100 m 14保石 A. 5 10% SDS 溶液 留水库 0 mL蒸馏水中,68℃助溶,盐酸调 pH至 馏 ENTE 至 100mL，室温 将 10 g SDS 90 保存。 R A.6裂解缓冲液 .80L蛋白酶K(5mg/mL）和20 SDS的混合 900μL TE缓冲液、 A. 7 DNA抽提缓冲液 的比例混合，密闭避光4℃ 将 Tris-HCl溶液饱和过的重蒸酚：氯仿：异戊醇以 25：24 保存。 A.8Taq酶缓冲液(10 倍 PCR buffer) 0.5mol/LpH8.8的Tris-HCl、0.5mol/ L的氯化钾（KCl)和1%的 TritonX-100 的混合 溶液。 A.9TAE电泳缓冲液(50倍) 将242.0gTris碱、37.2gNa2EDTA·2H²O混合，然后加人800mL的去离子水充分搅拌溶解，再 加人57.1mL的冰乙酸,充分混匀,加去离子水定容至1L,室温保存。 1）本附录所有试剂,除特别注明外,均采用分析纯的试剂。 4 SC/ T 7223. 2—2017 A.10 溴酚蓝指示剂溶液 取溴酚蓝100mg，加双蒸水5mL,在室温下过夜,待溶解后再称取蔗糖25g,加双蒸水溶解后移人 溴酚蓝溶液中,摇匀后加双蒸水定容至50mL,加人氢氧化钠(NaOH)溶液1滴,调至蓝色。 5