ICS 65.020.30 CCS B 41 SC 中华人民共和国水产行业标准 SC/T 7215—2021 流行性造血器官坏环死病诊断规程 Code of diagnosis for epizootic haematopoietic necrosis 2021-11-09发布 2022-05-01实施 中华人民共和国农业农村部 5发布 SC/T7215—2021 言 公共服务 食典通 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由农业农村部渔业渔政管理局提出。 本文件由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156)归口。 本文件起草单位：全国水产技术推广总站、中国检验检疫科学研究院、北京市水产技术推广站。 本文件主要起草人：张曼、王姝、余卫忠、王娜、潘勇、景宏丽、徐立蒲、蔡晨旭。 1 SC/T7215—2021 流行性造血器官坏死病诊断规程 1范围 本文件给出了流行性造血器官坏死病（epizootichaematopoieticnecrosis，EHN)诊断程序、试剂和材 料、仪器设备、临床症状、采样、病毒的分离和检测及综合判定的要求。 本文件适用于流行性造血器官坏死病的流行病学调查、诊断检疫和疫情监测。 2规范性引用文件 其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本 现的用改件 括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T6682 格 GB/T18088 境动物检 疫采样 SC/T7103 水生 检疫采样技术规范 3 术语和定义 L 要界的 本文件没有需 语利 UR 4缩略语 BF-2：蓝鳃太阳 鱼细胞系 CPE：细胞 CTAB：十六 化 miumbromi dATP：三磷酸 sphat) dCTP：三磷酸 dinetriphospha dGTP：三磷酸』 雀酸 metriphosphate dNTP:脱氧核糖 磷酸deo ucle side triphosphat dTTP：三磷酸胸腺 脱氧核胃酸cdeoxy ythymidinerriphosphate) EB：溴化乙啶（ethidiumbromide) EDTA：乙二胺四乙酸（eth ELISA：酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent EPC：鲤上皮瘤细胞系（epitheliomapapulosumcyprinicellline） FHM：胖头肌肉细胞系（fatheadminnowcellline） GCO：草鱼性腺细胞系（Ctenopharyngodonidellusovarycellline) HEPES：4-羟乙基哌嗪乙磺酸[4-（2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonicacid] IgG：免疫球蛋白G(immunoglobulinG) MCP：主要衣壳蛋白（majorcapsidprotein） OD：光密度（opticaldensity) PBST：含有Tween-20的磷酸盐缓冲液（phosphatebufferedsaline） PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction） Taq：水生嗜热菌（Thermusaquaticus）DNA聚合酶 TMB:3,3',5,5-四甲基联苯胺（3,3'5,5-Tetramethylbenzidine) SC/T7215—2021 5诊断程序 流行性造血器官坏死病的诊断程序包括5个阶段。其中，病毒分离培养阶段分为2个步骤,PCR检 测阶段分为3个步骤。诊断流程图如图1所示。 1采样（见9） 2.1样品处理 （见10.1.1） 病毒分离培养 （见10.1） 阳性 2.2 病毒接种 阳性3.1DNA提取 ELISA检测 与观察 （见10.3） （见10.1.2） （见10.2.1） 3.2PCR扩增 PCR检测 阴性 （见10.2.2） （见10.2） 3.3 琼脂糖凝 胶电泳及测序 （见10.2.4） 5综合判定（见11） 图1诊断流程图 6试剂和材料 6.1水：符合GB/T6682中一级水的规格。 6.2流行性造血器官坏死病毒参考株：由动物防疫主管部门指定单位提供。 6.3流行性造血器官坏死病毒单克隆抗体：由动物防疫主管部门指定单位提供。 6.4抗流行性造血器官坏死病毒血清：由动物防疫主管部门指定单位提供。 6.5酶标二抗IgG:按照说明书使用。 6.6细胞系：EPC、BF-2、FHM或GCO。 6.7TagDNA聚合酶：5U/μL，-20℃保存。 6.8dNTPs：含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各2.5mmoL/L，一20℃保存。 6.9MgCl2:25mmoL/L,-20℃保存。 6.10引物：浓度为10μmoL/L。序列如下： 正向引物F:5'CGC-AGT-CAA-GGC-CTT-GAT-GT3'; 反向引物R：5'AAA-GAC-CCG-TTT-TGC-AGC-AAA-C3'； 扩增蛙病毒MCP编码基因（见附录A），预期长度为585bp。 6.11无水乙醇：分析纯，使用前一20℃预冷。 6.12 琼脂糖：电泳纯。 6. 13 3封闭液：1%明胶。 6.14终止液：2moL/L的硫酸。 6. 15 PCR阳性对照：含有已知EHNV参考株的细胞悬液或已知感染EHNV的组织。 6. 16 PCR阴性对照：不含EHNV病毒的正常细胞悬液或正常组织。 6. 17 细胞培养液：按照附录B中的B.1配制，也可使用商品化试剂。 2 SC/T7215—2021 7仪器设备 7.1超净工作台。 7.2生化培养箱。 7.3 倒置显微镜。 7.4普通冰箱及超低温冰箱。 7.5冷冻离心机。 7. 6 高压灭菌锅。 7. 7 组织研磨器。 7. 8 PCR仪。 7. 9 电泳仪。 PUBLI 7. 10 微波炉。 7. 11 凝胶成像仪。 7. 12 酶标仪。 8 临床症状 患病鱼临床症状 RAL 9采样 9.1采样对象 虹鳟和河鲈 易感 9.2采样数量 去和保存运车 及保存运车 采样数量、 9.3样品的采集 2 体长<4cm的鱼 括肾）；体长>6cm 的鱼则取肝、脾、肾 病毒的分离和检测 10.1病毒分离培养 10.1.1样品处理 用组织研磨器将样品匀浆成糊状，按1：10的比例将其重悬于含有1000IU/mL青霉素和1000μg/ml 链霉素的细胞培养液中，于15℃下孵育2h～4h或4℃下孵育 6h 24h。7000r/min，4℃离心 20min，收集上清液。 10.1.2病毒接种与观察 1000三个稀释度的上清液接种到生长约24h的单层EPC、BF-2、FHM或GCO细胞上，每个样品至少接 种3孔，每孔接种100μL，置于22℃培养。试验设置3孔阳性对照（接种病毒参考株）和3孔空白对照 （未接种病毒的细胞）。 10.1.2.2用倒置显微镜观察CPE是否出现，连续观察7d。CPE表现为细胞收缩变圆，进而大量崩解， 单层细胞形成空洞，边缘细胞颗粒化，最终细胞全部脱落。如果7d内接种组织匀浆上清液的细胞培养物 未出现CPE，需盲传一次。盲传时，将接种组织匀浆上清液的细胞培养物冻融一次后收集，7000r/min， 4℃离心20min，收集上清液。将上清液100μL接种到同种长满单层新鲜细胞的96孔板中，置于22℃ 培养，再观察7d。 3 SC/T7215—2021 10.1.2.3如果空白对照细胞形态正常，阳性对照孔细胞出现CPE，当接种被检匀浆上清稀释液的细胞 或盲传后的细胞出现CPE时，立即取病毒悬液用PCR或ELISA方法进行病毒的检测。 10.1.3结果判定 在阳性对照出现CPE的情况下： b）样品经过接种细胞和盲传后均没有CPE出现，则结果判为阴性。 阳性对照未出现CPE，则试验无效，应重新进行试验。 10.2PCR检测 10.2.1DNA提取 10.2.1.1取50mg~100mg组织，或100μL~200μL冻融2次的细胞培养物。先加入150μLCTAB 溶液（按照B.2配制），用组织研磨器将样品匀浆成糊状，放入1.5mL的离心管中，再将CTAB溶液补加 至900μL。若样品为出现CPE的细胞悬液，则先将细胞悬液反复冻融3次，再取450μL细胞悬液加人 450μLCTAB溶液混匀。25℃作用2h～2.5h。 10.2.1.2在含有样品的离心管中加入600μL抽提液1（按照B.3配制),充分混合不少于30s。 10.2.1.3以12000r/min离心5min，取上层水相（约800μL)，再加入700μL抽提液Il（按照B.4配 制），充分混合至少30s。 10.2.1.412000r/min离心5min，取上层水相（约600μL），再加入一20℃预冷的1.5倍体积的无水乙 醇（约900μL），颠倒数次混匀后，一20℃沉淀8h以上。 10.2.1.512000r/min离心30min，弃上清液。室温干燥后加20μL水溶解，用作PCR模板。 10.2.1.6也可使用同等抽提效果的其他方法或使用商品化试剂盒抽提病毒DNA。 10.2.2PCR扩增 dNTPs8.0μL、上下游引物各2.5μL、TaqDNA聚合酶1μL，模板6μL,加水至总体积为100μL。瞬时 离心，将反应管置于PCR扩增仪，反应条件：95℃预变性4min，95℃1min，55℃1min，72℃1min，扩 增35个循环；72℃延伸10min，最后4℃保存。 10.2.3设立对照 实验过程中须设立阳性对照（见6.15）、阴性