ICS 65.020.30 B 41 SC 中华人民共和国水产行业标准 SC/T 7204.5—2020 对虾桃拉综合征诊断规程 第5部分：逆转录环介导核酸 等温扩增检测法 Diagnostic protocols for taura syndrome of penaeid shrimp- Part 5: Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification 2020-08-26发布 2021-01-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 SC/T7204.5—2020 K 品标准 前业 全国 第1部分：外观症状诊断法； 第2部分：组织病理学诊断法； 第3部分：RT-PCR检测法； 第4部分：指示生物检测法； 第5部分：逆转录环介导核酸等温扩增检测法； 本部分为SC/T7204.1的第5部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由农业农村部渔业渔政管理局提出。 本部分由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156)归口。 本部分起草单位：中国水产科学研究院黄海水产研究所。 本部分主要起草人：张庆利、黄健、万晓媛、徐婷婷、梁艳、邱亮、桑松文、杨冰、李晨。 SC/T7204.5—2020 对虾桃拉综合征诊断规程第5部分：逆转录 环介导核酸等温扩增检测法 1范围 本部分给出了对虾桃拉综合征病毒逆转录环介导核酸等温扩增检测法所需试剂和材料、器材和设备、 操作步骤和结果判定的要求。 本部分适用于对虾桃拉综合征的初筛检测 2规范性引用文件 PUBL 日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用 SC/T7204.3 金行诊断 3缩略语 下列缩略语适用 于7 Bst酶：Bs 热启 DNA聚合雨BS dNTP:脱 Cdeoxyribomialepside M-MLV M-MLV 转录酶(reveeanscriptaseMMR) RT-LAMIP ranser nplification) TSV：桃拉 合征病每（1 irus 4试剂和材料 4.1除非另有说甲 分析纯的试剂 的水。 4.2引物TSV 200 引物TSV TIGGA AT-3 ,10. molt 引物TSV-FI C TAG ACG TTC CAG T-3',20 μmol) 2kC 引物TSV-BIP：5 A PTCAYTAC GTT CTACCATGAGTI AAICTA-3',20μmol/L 0℃保存 4.310XIsothermal Ampli 为1×工 液时内含20mmol/LTris-HCl， 50mmol/LKCl,10mmol/L(NHQS .2 mmol/L MgSO..0. Tween?20，或其他等效等温扩增缓 冲液。 4.4dNTP（各20mmol/L）：含dATP、dTTP、dCTP、dGTP各20mmol/L，按附录A中A.1的规定执 行，一20℃保存，避免反复冻融。 4.5甜菜碱（Betaine)：浓度5mol/L，按A.2规定执行，一20℃保存，避免反复冻融。 4.6 硫酸镁（MgSO,）：浓度100mmol/L，一20℃保存。 4.7 M-MLV逆转录酶：酶浓度200U/μL，一20℃保存，避免反复冻融。 4.8 BstDNA聚合酶：酶浓度8U/uL，一20℃保存，避免反复冻融。 4.9 核酸染料：20XEvaGreen，商品化试剂，4℃保存，或其他等效核酸染料。 4. 10 阳性对照为已知感染TSV且RT-PCR结果显示明显阳性的对虾组织，一80℃保存。 4.11 阴性对照为已知未感染TSV且RT-PCR结果显示阴性的对虾组织，一80℃保存。 1 SC/T7204.5—2020 4. 12 空白对照为RNase-free水。 5 器材和设备 5. 1 微量移液器。 5. 2 离心机。 5.3 手掌型离心机。 5.4普通冰箱。 5. 5 一80℃超低温冰箱。 5.6 涡旋振荡器。 5.7 无RNA酶的1.5mL离心管。 5.8 3无RNA酶的0.2mLPCR管。 5.9 无RNA酶的微量移液枪头。 5. 10 实时荧光定量PCR仪。 6 操作步骤 6.1样品的准备和RNA的提取 商品化试剂盒。 6.1.2核酸提取完成后测定RNA浓度和质量，将RNA稀释为10ng/uL～100ng/uL,取10μL分装于 0.2mLPCR管中，在65℃条件下保温15min，然后迅速置于冰上，完成核酸的变性。 6.2RT-LAMP检测 6.2.1反应体系配制 按表1的要求，在冰盒上的低温状态下配制RT-LAMP检测反应体系，混匀后，分装为24μL/管；同 时设置空白对照、阴性对照和阳性对照。空白对照中加人1μLRNase-free水作为模板，阴性对照、待检样 品、阳性对照中分别次序加入1μL、总量为10ng～100ng的变性RNA作为模板 表1RT-LAMP反应预混物所需试剂 试剂 加样量，μ 试剂终浓度 10X Isothermal Amplification Buffer 2. 5 1X MgSO,(100mmol/L) 1. 0 4. 0 mmol/L Betaine (5mol/L) 6.0 1. 2 mol/L, dNTP（各20mmol/L) 1. 5 1.2mmol/L TSV-FIP (20 μmol/L) 2.0 1. 6 μmol/L TSV-BIP (20 μmol/L) 2.0 1. 6 μmol/L TSV-F3 (10 μmol/L) 0.5 0. 2 μmol/L TSV-B3 (10 μmol/L) 0.5 0. 2 μmol/L M-MLV逆转录酶（200U/μL） 0. 2 1.6 U/μL BstDNA聚合酶（8U/μL) 1. 0 0. 32 U/μL Eva Green (25 μmol/L) 0. 8 0.8 μmol/L RNasc-free水 6. 0 反应体系配制也可采用同等效果的商业化RT-LAMP试剂盒代替。 注：扩增靶序列参见附录B，推荐实验室分区和污染控制措施见附录C。 6.2.2 反应条件 各样品置于实时荧光定量PCR仪中，选择SYBR通道，63℃反应60min。 2 SC/T 7204.5—2020 7结果判定 7.1阳性对照反应产生典型“S"形扩增曲线且空白对照和阴性对照反应产生非“S"形扩增曲线时，检测 实验成立。 7.2 2待检样品反应产生典型“S形扩增曲线，则判定该样品为TSV阳性 7.3 3待检样品反应产生类似平直的非扩增曲线，则判定该样品为TSV阴性。 3 SC/T7204.5—2020 附录A （规范性附录） 检测相关试剂配方 A. 1 dNTP(各 20 mmol/L) 商品化试剂含dATP、dTTP、dCTP和dGTP各1管，每管400L，浓度为100mmol/L，化冻后将上 述dATP、dTTP、dCTP和dGTP混合·再加人 400μL的无RNA酶水，充分混勺，分装到多个1.5mL的 EP管中，一20℃保存，避免反复冻融 P A.2 甜菜碱（5mol/L 称取2.93g甜菜碱 终体积为5mL，混勾并分 装至多个1.5mL EP 保存 SC/T 7204.5—2020 附 录B （资料性附录） TSVRT-LAMP检测引物设计及其在靶基因中的位置 RT-LAMP引物在TSV靶基因中的位置见图B.1。 F3 F2 Blc 56 TCTTAGACCCCATTTCCTTACTTTCCCCCGAATTTCCTTTCCCACACATAATTCA AGAATCTCCCCTAAACCAATCAAACCGCCCTTAAACGAAACCGTCTCTATTAAGT Flc 11 TTACCCCAGACCTTACTTAACATTATTTCATATATGTATACGTTCACTCATGGTA B2 66 CCATATCCTACAAAATTATTCCTAACAATAACCCCGATCT CGTATAGGATGTTTTAATAAGGATTCTTATTCCCCCTAGA B3 注：该序列的GenBank号为AY997025；图中序列为对虾桃拉综合征病毒（TSV)核酸等温扩 增的产物序列，其中TSV-FIP由F1c+F2组成，TSV-BIP由Blc+B2组成。 图B.1RT-LAMP引物在TSV靶基因中的位置 5