ICS65.150 B 50 SC 中华人民共和国水产行业标准 SC/T 7016.14—2019 鱼类细胞系 第14部分：锦鲤吻端细胞系（KS） Fish cell lines-Part 14:Koi snout cell line (KS) 2019-08-01发布 2019-11-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 SC/T7016.14—2019 前 茶 司 SC/T7016《鱼类细胞系》为分部分标准，拟分为如下部分内 第2部分：草鱼肾细胞系（CIK)； 第3部分：草鱼卵巢细胞系（CO)； 第4部分：虹鳟性腺细胞系（RTG-2)； 第5部分：鲤上皮瘤细胞系（EPC)； 第6部分：大鳞大麻哈鱼胚胎细胞系（CHSE)； 第7部分：棕细胞系（BB)； 第8部分：斑点叉尾卵巢细胞系（CCO)； 第9部分：蓝鳃太阳鱼细胞系（BF-2)； 第10部分：狗鱼性腺细胞系（PG）； 第11部分：虹鳟肝细胞系（R1）； 第12部分：鲤白血球细胞系（CLC）； 第13部分：鲫细胞系（CAR)； 第14部分：锦鲤吻端胚细胞系（KS)； 本部分为SC/T7016的第14部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意文本的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由农业农村部渔业渔政管理局提出。 本部分由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156)归口。 本部分起草单位：中国水产科学研究院珠江水产研究所。 本部分主要起草人：王庆、王英英、曾伟伟、李莹莹、尹纪元、刘春、任燕、常藕琴、石存斌。 I SC/T 7016.14—2019 鱼类细胞系 第14部分：锦鲤吻端细胞系（KS） 1范围 本部分规定了锦鲤吻端细胞系的术语和定义、缩略语、试剂和耗材、器材和设备、细胞形态与特性、细 胞培养条件、细胞传代和保存、质量检查 本部分适用于锦鲤吻端细胞系的培养、使用和保藏。 2规范性引用文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本 S 3. 1 锦鲤吻端细胞 系koi snoutcell Jine(KS) 2011年，用锦鲤的吻 需组织经原代培养行生 UR 4缩略语 下列缩略语 用手本文件 GCRV:草鱼 乎肠孤光 KHV：锦鲤 疹病毒 kotherpesi 5试剂和材料 5.1水 应符合GB/T6682 级水的 5.2细胞培养液 配制方法参见附录 5.3细胞消化液 配制方法参见附录A.2。 5.4PBS缓冲液 配制方法参见附录A.3。 5.5细胞冻存液 配制方法参见附录A.4。 5.6血清 胎牛血清(FetalBovineSerum，FBS)。 5.7试剂耗材 细胞培养瓶、移液器、移液管以及冻存管等培养细胞所用的耗材。 6器材和设备 6.1培养箱（可恒温27℃)。 SC/T 7016. 14—2019 6.2超净工作台。 6.3生物安全柜。 6.4倒置显微镜。 6.5细胞计数仪。 6.6液氮冻存罐。 7细胞形态与特性 7.1 形态 为上皮细胞，细胞呈椭圆形(参见附录B中图B.1)。 7.2大小 经细胞实时分析系统测定细胞悬浮后的平均直径约13.5μm(参见附录C)。 7.3特性 7.3.1生长特性 贴壁生长，传代后10h内细胞贴壁，24h后能基本长满单层细胞。 7.3.2对部分水生动物病原的敏感性 KS对KHV、GCRV等病毒敏感，KS接种KHV后，置于22℃培养，3d～4d，细胞出现空泡状CPE， 5d～7d,细胞单层呈网状；接种GCRV后，置于27℃培养，4d～5d,细胞出现融合性病变，随培养时间的 延长，细胞逐渐脱落，接种后的CPE形态参见图B.2和B.3。 8细胞培养条件 8.1培养温度 细胞置于生化培养箱内，在15℃～32℃下培养，最适生长温度为27℃。 9细胞传代和保存 9.1传代 9.1.1吸弃 挑选长满单层KS细胞的培养瓶，置超净工作台内，吸出旧培养液。 9.1.2消化和分散 用细胞消化液消化分散细胞。沿细胞培养瓶一侧加人细胞消化液，一般在25cm²细胞培养瓶中加人2 mL左右或按细胞培养瓶培养面每平方厘米加人0.05mL～0.1mL,加入量必须完全浸没细胞层。贴壁长满 的KS消化时间一般为2min～3min,细胞开始变圆便吸弃细胞消化液，轻轻拍打培养瓶以分散细胞。 9.1.3分瓶 拍打分散细胞后，在25cm²细胞培养瓶中加入10mL～15mL细胞培养液（参见附录A.1），按每瓶5 mL分成2瓶3瓶，使细胞终浓度达到1×105个/mL2×105个/mL。在27℃培养，10h内细胞贴壁并 生长；24h后能基本长满单层细胞。 9.1.4传代周期 细胞长满单层2d～3d后可再次传代。 9.2保存 9.2.1低温保存 传代后的KS经27℃下24h的培养后，移人培养箱15℃或20℃保藏。在15℃下可保存60d，20℃ 下可保存30d。 9.2.2冻存 在液氮中冻存，将一瓶25cm²的长满单层的KS细胞按9.1.2进行消化和分散。加入5mL细胞培 2 SC/T 7016. 14—2019 养液重悬细胞，将重悬后细胞离心，吸弃细胞培养液。加人1.5mL细胞冻存液（参见A.4)重悬细胞（细 胞终浓度1×107个/mL～2×10°个/mL），置于1.8mL冻存管中，保种细胞应经逐步降温后放人液氮中。 10质量检查 传代细胞的质量检查包括： a）一年内至少要进行一次病毒敏感谱的检测； b）在移生化培养箱的第2d用倒置显微镜观察细胞形态、生长情况，连续观察7d～10d； c) 可根据培养液中酚红的颜色判定培养液的pH是否保持在7.2～7.6，若pH不合适，可采取换 液的方法； (P 细胞培养液浑浊或出现丝状物时，视为细菌或真菌污染，将细胞高温高压灭菌后丢弃； e) 1年至少要进行1次支原体检测。 3 SC/T7016.14—2019 附录A (资料性附录) 试剂配制 A.1 细胞培养液 根据Leibovitz'sL-15培养基（含L-谷氨酰胺）说明书要求，在容器中加入1L水，并将容器放到磁力 搅拌器上，边搅拌便加人L-15培养基（含 L-谷氨酰胺）干粉。 当充分搅匀和溶解后，加人10%的胎牛血 SHING 20℃保存。 A.2 细胞消化液 Na2HPO4·12H,O KH,PO4 NaCl KCI RAL EDTA 胰酶 水 1000ml 在1L水中 顺序加 L试剂,以NaHCO 消化液pHI.充分搅拌至完全 容解店 过滤除菌并分装， -20℃保存。 工 A.3PBS缓冲液 NaCl KCl NaH2PO4 KH2PO4 加去离子水800 mL: nL高压灭菌并分装，室 温保存。 A.4 细胞冻存液 Leibovitz'sL-15培养基（含L-谷氨酰胺)胎牛血清和二甲基亚砜（DMSO），三者按照7：2：1的比 例配制而成。 SC/T 7016.14—2019 附录B （资料性附录） KS及其接种病毒产生的CPE形态图 B.1正常KS细胞 见图B.1。 图B.1正常KS细胞 B.2 2KS在接种KHV后出现的CPE 见图B.2。 图B.2KS在接种KHV后出现的CPE