ICS 65.150 B 50 SC 中华人民共和国水产行业标准 SC/T 7016.13—2019 鱼类细胞系 第13部分：鲫细胞系（CAR） Fish cell lines-—Part 13:Carassius auratus cell line(CAR) 2019-08-01发布 2019-11-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 SC/T7016.13—2019 前 SC/T7016《鱼类细胞系》为分部分标准，拟分泌如下部杀 -第1部分：胖头鳞肌肉细胞系（FHM)； IV 第2部分：草鱼肾细胞系（CIK）； 第3部分：草鱼卵巢细胞系（CO)； 第4部分：虹鳟性腺细胞系（RTG-2）。 第5部分：鲤上皮瘤细胞系（EPC)； -第6部分：大鳞大麻哈鱼胚胎细胞系（CHSE)； 第7部分：棕细胞系（BB)； 第8部分：斑点叉尾卵巢细胞系（CCO)； -第9部分：蓝鳃太阳鱼细胞系（BF-2)； 第10部分：狗鱼性腺细胞系（PG)； 第11部分：虹鳟肝细胞系(R1)； 第12部分：鲤白血球细胞系（CLC)； 第13部分：鲫细胞系（CAR）； 第14部分：锦鲤吻端胚细胞系（KS)； 本部分为SC/T7016的第13部分。 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由农业农村部渔业渔政管理局提出。 本部分由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156)归口。 本部分起草单位：北京市水产技术推广站、中国检验检疫科学研究院动物检疫研究所。 本部分主要起草人：徐立蒲、景宏丽、王姝、曹欢、潘勇、张文、王静波、王小亮、那立海、江育林。 I SC/T 7016.13—2019 鱼类细胞系 第13部分：鲫细胞系（CAR） 1范围 本部分规定了鲫细胞系的术语和定义，缩略语，试剂与材料，器材与设备，细胞形态、大小与特性，细胞 培养条件，细胞传代与保存，质量检查。 本部分适用于CAR的培养、使用和保藏 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注B均的引用文件仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本括所有 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 N 3术语和定义 RESEA 下列术语和定义适户 S 3. 1 鲫细胞系 ssius auratus cell line.简称 CAR cara 1364 来源于ATCC Aneric anTypeCulturColection）编号CL-7l该细胞 年由Clem建立。 UR 缩略语 下列缩略语适月 用于本文 ADIV：大鲩虹 彩病毒（ (andrias davidianus iridovirus) BIV:玻勒虹彩 与毒Obo EHNV：流行性 bizootie haematopoictic necrosl GCRV：草鱼呼肠 孤病毒 5试剂与材料 K 5.1水 应符合GB/T6682中 级水的规定 5.2细胞培养液 配制方法参见附录A或使用商品化试剂。 器材与设备 主要包括： a) 生化培养箱； b) 超净工作台； c) 倒置显微镜； d) 液氮罐； e) 细胞培养瓶、移液管等耗材。 7 细胞形态、大小与特性 7. 1 形态 SC/T 7016. 13-2019 上皮样细胞，细胞呈纤维状(参见附录B)。 7.2大小 经细胞实时分析系统测定细胞悬浮后的平均直径约14.0μm(参见附录C)。 7.3特性 7.3.1生长特性 贴壁生长,8h内细胞贴壁并生长;18h后能基本长满单层细胞。 7.3.2对部分水生动物病毒的敏感性 对GCRV、EHNV、ADIV和BIV等病毒敏感（参见附录B)。 8 细胞培养条件 细胞置生化培养箱内，在15℃～25℃下培养，最适生长温度为25℃。 9细胞传代与保存 9.1 传代 9.1.1吸弃 置超净工作台内，无菌环境下吸弃长满单层CAR细胞培养瓶中的旧培养液。 9.1.2消化和分散 沿细胞培养瓶一侧加人细胞消化液，一般在25cm²细胞培养瓶中加入1mL～2mL，或按照细胞培养 瓶培养面每平方厘米加人0.1mL。贴壁长满的CAR消化时间一般为2min～3min，细胞开始呈雾状之 后吸弃细胞消化液，拍打培养瓶以分散细胞。 9.1.3分瓶 将消化液吸弃后，在25cm²细胞培养瓶中，加入10mL细胞培养液，振荡摇匀，按每瓶5mL分成2 瓶，使细胞终浓度达到1×105个/mL～2×105个/mL。分瓶后在25℃下培养，8h内细胞贴壁并生长， 18h后基本长满单层细胞。 9.1.4传代周期 细胞长满单层并在上次传代7d后可再次传代。 9.2保存 9.2.1低温保存 传代后的CAR经25℃培养24h～72h后，移入生化培养箱，16℃保藏。在16℃下至少可保存30d。 9.2.2冻存 在液氮中冻存细胞。将一瓶25cm²长满单层的CAR细胞按照9.1.2进行消化和分散，消化后加人 含有10%的二甲基亚砜(DMSO)、20%血清的细胞培养液，细胞终浓度1×107个/mL～2×10?个/mL，置 于2mL冻存管，经程序降温后放人液氮。 10质量检查 传代细胞的质量检查包括： a）培养的CAR，依据7.3.2每年内进行一次病毒敏感谱的检测； b）在移人生化培养箱后持续用倒置显微镜观察细胞形态、生长情况； c）可根据培养液中酚红的颜色,判定培养液的 pH 是否保持在 7.2～7.6; d）细胞培养液浑浊或出现丝状物时，视为细菌或真菌污染，将该瓶细胞丢弃。 2 SC/T 7016. 13—2019 附录A (资料性附录) 配制方法 A.1细胞培养液 根据M199培养基说明书要求，在容器中加人适量的一级水，并将容器放到磁力搅拌器上，边搅拌边 加人M199培养基干粉。当充分搅匀和溶解后，加人10%经56℃、30min灭活的胎牛血清；用NaHCO3 粉末调节培养液的pH至7.2～7.4。尽快过滤除菌，分装后一20℃保存。 A.2 细胞消化液 Na2HPO4· 12H20 2.3 g KH2PO4 0.1 g NaCI 8.0 g KCl 0.2 g EDTA 0.2 g 胰酶 0. 6 g 水 1 000 mL 在1L水中顺序加人以上试剂,并加人NaHCO30.4g～0.6g，因pH<7.4时EDTA难溶，必须将 pH调节至7.4～8.0。充分搅拌至完全溶解后，过滤除菌并分装，一20℃保存。 3 SC/T7016.13—2019 附录B （资料性附录） CAR形态图及病毒的致细胞病变效应(CPE)图 B.1长满单层正常的CAR 正常的CAR细胞呈纤维状，形态一致，排列紧密，见图B.1 TURAL B.1长满单层正常的CAR形态图（40X相差 B.2CAR在接种病 毒后 出现的CPE B.3 图B.2ADIV产生的CPE图（50×相差） 图B.3GCRV产生的CPE图(50×相差） SC/T7016.13—2019 附录C (资料性附录） 细胞实时分析系统测定的CAR悬浮特性 细胞实时分析系统测定的CAR悬浮特性见图C.1。 细胞数 150 100 上 6 12 18 24 30 36直径,μm 注：细胞计数为8126个；平均体积为1.45pL；平均直径为14.0μm。 图C.1 细胞实时分析系统测定的CAR悬浮特性 5