ICS 67.120.30 X 20 SC 中华人民共和国水产行业标准 SC/T 3053—2019 水产品及其制品中虾青素含量的测定 高效液相色谱法 Determination of astaxanthin in fish and fishery products by high performance liquid chromatography method 2019-11-01实施 2019-08-01发布 中华人民共和国农业农村部发布 SC/T 3053—2019 前 言 全 V 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由农业农村部渔业渔政管理局提出。 本标准由全国水产标准化技术委员会加工分技术委员会（SAC/TC156/SC3)归口。 本标准起草单位：中国水产科学研究院黄海水产研究所、辽渔南极磷虾科技发展有限公司、山东鲁华 海洋生物科技有限公司。 本标准主要起草人：孙伟红、邢丽红、王联珠、冷凯良、丛心缘、刘冬梅、范宁宁、付树林、李兆新、李风 玲、郭莹莹、朱文嘉、彭吉星 I SC/T 3053—2019 水产品及其制品中虾青素含量的测定高效液相色谱法 1范围 本标准规定了水产品及其制品中虾青素含量的高效液相色谱测定方法的原理、使用的试剂及仪器、测 定步骤、结果计算方法、方法灵敏度、准确度和精密度。 本标准适用于鱼类、甲壳类及虾粉、磷虾油等制品中虾青素含量的测定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T30891水产品抽样规范 3原理 的虾青素，液相色谱分离，紫外检测器测定，外标法定量。 4试剂 4.1除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。 4.2丙酮(CH:COCHs）：色谱纯。 4.3二氯甲烷(CHzCl2）：色谱纯。 4.4甲醇(CHOH):色谱纯。 4.5叔丁基甲醚[CH3OC(CH3)3]：色谱纯。 4.6磷酸（HPO4）：优级纯。 4.7氢氧化钠(NaOH)：优级纯。 4.82，6-二叔丁基对甲酚(C1sH24O)：化学纯。 4.9 碘(I2)。 4.10硫代硫酸钠(Na2S2O3·5H2O)。 4.11无水碳酸钠(Na2CO3）。 4.12无水硫酸镁（MgSO4）：650℃灼烧4h，在干燥器内冷却至室温，储于密封瓶中备用。 4.131%磷酸溶液（V/V）：量取10mL磷酸和990mL水，混匀后备用。 4.14二氯氟甲烷-甲醇溶液：量取250mL二氯甲烷和750mL甲醇，加入0.5g2，6-二叔丁基对甲酚，混 匀后备用。 4.150.02mol/L氢氧化钠甲醇溶液：称取0.4g氢氧化钠，用甲醇溶解并稀释至500mL，混匀后备用。 4.160.6mol/L磷酸甲醇溶液(V/V)：量取磷酸600μL，用甲醇稀释至10mL。 4.170.01g/mL碘-二氯甲烷溶液：称取0.1g碘，用二氯甲烷溶解并稀释至10mL，混匀后备用。 4.180.1mol/L硫代硫酸钠溶液：称取1.3g硫代硫酸钠，加入0.01g无水碳酸钠，溶于50mL水中， 缓缓煮沸10min，冷却后备用。 4.19全反式虾青素标准品：纯度≥95%。 4. 20全反式虾青素标准储备溶液：准确称取全反式虾青素标准品约10 mg,用丙酮溶解并定容于 500 1 SC/T3053—2019 mL容量瓶中，此溶液浓度为20ug/mL，充氮密封，置于一18℃冰箱中避光保存，有效期1个月。 10μg/mL的标准溶液，移取2mL标准溶液于10mL具塞试管中，加入3mL二氯甲烷，混勾，加入50uL 0.01g/mL碘-二氯甲烷溶液（4.17），充分涡旋，密封置于自然光下反应15min，然后加人1mL0.1mol/L硫 代硫酸钠溶液（4.18)充分振荡以脱除多余的碘后，静置分层取下相，氮气吹干后加人1mL丙酮溶解，现用 现配。 4.22N-丙基乙二胺(PSA)填料：粒径40μm～60μm。 5仪器 5.1高效液相色谱仪：配紫外检测器 5.2分析天平：感量0.01g。 5.3分析天平：感量0.0001 5.4分析天平：感量0.00001 5.5超声波清洗仪， 5.6离心机：转速8 min E Q 5.7涡旋混合器 CENT 5.8氮吹仪。 6测定步骤 C LTUR 6.1试样制备 取代表性试样， ,按GB/T 30891的规定 6.2提取 C 称取试样 羊 2 g(准确到） Jo.01g）于50mL离管中，加人4g无水MgSO. ml丙酮，充分涡 旋，15℃以下超声波提取15min.8.000m离心5min.收集上清液于50 mL离心管中，残渣中加人 10mL丙酮重复以上 过程合 并提取液，混匀 S 6.2.2虾粉 E 称取试样1g 2g（准确到 0.01g 于50mL离心管中，加入20mL丙酮，15℃以下超声波提取 15min，8000r/min离心5mi收集上清液 NIHS. 合并提取液，混匀。 6.2.3磷虾油 （4.14），涡旋混匀，15℃以下超声波提取20min，8000r/min离心5min。 注：虾青素含量高于100mg/kg的南极磷虾油的称样量不大于0.2g。 6.3皂化和净化 准确移取2mL样品提取液于10mL具塞试管中，加入2.9mL0.02mol/LNaOH甲醇溶液 （4.15），涡旋混合，充氮密封，在4℃～5℃冰箱中反应过夜12h～16h。然后在试样溶液中加入0.1mL 0.6mol/L磷酸甲醇溶液（4.16）中和剩余的碱，再加入100mgPSA填料，涡旋混合，静置5min，过 0.2μm微孔滤膜后，待测。 6.4测定 6.4.1色谱条件 a） 色谱柱：C3色谱柱，250mmX4.6mm，5μm，或相当者； b)7 柱温：25℃； 2 SC/T 3053—2019 c）流速:1.0 mL/min。 d) 检测波长：474nm。 e) 流动相：A为甲醇,B为叔丁基甲基醚,C为1%磷酸溶液；梯度洗脱程序见表1。 表1流动相梯度洗脱程序 时间，min A,% B,% C.% 0 81 15 4 15 66 30 4 23 16 80 4 27 16 80 4 30 81 15 4 35 81 15 4 6.4.2标准曲线绘制 准确移取适量全反式虾青素标准储备溶液（4.20）用试样定容溶剂稀释成浓度分别为0.1uμg/mL、 0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL的标准工作液，现用现配。 6.4.3液相色谱测定 6.4.3.1定性方法 分别注人20μL全反式虾青素标准工作液（6.4.2）、虾青素几何异构体（4.21)和试样溶液（6.3），按 6.4.1列出的色谱条件进行液相色谱分析测定，根据虾青素几何异构体色谱图中13-顺式虾青素、全反式 虾青素和9-顺式虾青素3种虾青素同分异构体组分的保留时间定性。色谱图参见附录A。 6.4.3.2定量方法 根据试样溶液中虾青素的含量情况，选定峰面积相近的全反式虾青素的标准工作液单点定量或多点 校准定量，试样测定结果以3种虾青素同分异构体的总和计，外标法定量，同时标准工作液和样液的响应 值均应在仪器检测的线性范围之内。 7结果计算 试样中虾青素的含量（X）按式(1)计算，保留3位有效数字。 A Xm 式中: x 样品中虾青素的含量，单位为毫克每干克（mg/kg）； 1.3 -13-顺式虾青素对全反式虾青素的校正因子； A13-cis 试样溶液中13-顺式虾青素的峰面积； A trans 试样溶液中全反式虾青素的峰面积； 1. 1 -9-顺式虾青素对全反式虾青素的校正因子； Ag-cis 试样溶液中9-顺式虾青素的峰面积； C, 标准工作液中全反式虾青素的含量，单位为微克每毫升（ug/mL）； V 试样溶液体积，单位为毫升（mL）； A. 全反式虾青素标准工作液的峰面积； m 样品质量，单位为克（g）； f 稀释倍数。 8方法定量限、回收率和精密度 8.1定量限 鱼类、甲壳类中虾青素的定量限为2.5mg/kg，虾粉中虾青素的定量限为5mg/kg，磷虾油中虾青素 3 SC/T 3053—2019 的定量限为10mg/kg。 8.2回收率 本方法添加浓度为2.5mg/kg~100mg/kg时，回收率为90%~110%。 8.3精密度 本方法的批内变异系数≤10%，批间变异系数<10%。 G SC/T 3053—2019 附录A (资料性附录） 色 谱 图 A.1异构化的标准溶液色谱图 见图A.1。 mAU 70 0 40 GT 20 图A异构化的虾青素标准溶液色谱图 见图A.2。 RE mAu 40 30 20 10 0 -10 min 0 10 20 图A.2 全反式虾青素标准溶液色谱图(1μg/mL)