ICS 65.150 B 51 SC 中华人民共和国水产行业标准 SC/T 2094—2020 中间球海胆 Japanese sea urchin 2020-08-26发布 2021-01-01实施 中华人民共和国农业农村部 、发布 SC/T2094—2020 前业 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本标准的某些内容可能涉及专利，本标准的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由农业农村部渔业渔政管理局提出。 本标准由全国水产标准化技术委员会海水养殖分技术委员会（SAC/TC156/SC2)归口。 本标准起草单位：大连海洋大学。 本标准主要起草人：常亚青、张伟杰、湛垚垚、周贺、陈小慧、孙景贤、丁君、宋坚、赵冲。 I SC/T2094—2020 中间球海胆 1范围 本标准给出了中间球海胆[Strongylocentrotusintermedius（Agassiz，1863）］的术语和定义、名称与 分类、主要形态构造特征、生长与繁殖特性、细胞、遗传学特征、分子遗传学特征、检测方法和判定规则。 本标准适用于中间球海胆的种质检测与鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T18654.2养殖鱼类种质检验第2部分：抽样方法 GB/T18654.12养殖鱼类种质检验第12部分：染色体组型分析 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3. 1 壳径testdiameter 口面朝下放于水平面上，横切海胆外壳所得最大圆面的外径长。 3. 2 壳高testheight 肛门到口面中心的不包括棘刺的垂直距离。测量方法见图1。 TD：壳径 TH：壳高 壳径 壳高 图1中间球海胆壳径和壳高的测量方法 3. 3 口面oral side 口部所在的壳面。 3. 4 反口面aboral side 肛门所在的壳面。 3.5 管足tubefeet 水管系统伸出壳外的细长的管状器官，具有吸附、运动、感觉、摄食等功能。 1 SC/T 2094—2020 3. 6 棘 spine 生长于壳上细长的针状刺。 3.7 步带区ambulacraarea 外壳上伸出管足的区域。 3. 8 间步带区interambulacra area 外壳上不伸出管足的区域。 4名称与分类 4.1学名 中间球海胆[Strongylocentrotus intermedius（Agassiz，1863)]。 4.2分类地位 隶属于棘皮动物门（Echinodermata）游走亚门（Eleutherozoa）海胆纲（Echinoidea）正形目（Centrochi- noida)球海胆科（Strongylocentrotidae)球海胆属（Strongylocentrotus）。 5主要形态构造特征 5.1外部形态 壳呈低半球形，成体壳高介于15mm~40mm，壳径介于30mm~80mm，最大壳高可达50mm，最 大壳径可达100mm。口面平坦且稍向内凹，反口面隆起稍低，顶部比较平坦。步带区与间步带区幅宽不 等，赤道部以上步带区幅宽为间步带区的2/3，两区自口面观接近于圆润的正五边形。体表的色泽变异较 大，多以绿褐色和黄褐色为主。大棘针形，短而尖锐，长度为5mm～8mm，在水中管足细长、淡黄透亮。 外部形态见图2。 a）口面 b）反口面 图2外部形态 5.2可量性状 6月龄、12月龄、18月龄和22月龄中间球海胆壳高与壳径的比值平均值分别为0.48土0.08、0.49士 0.02、0.55±0.03和0.59土0.04。年龄判定参考养殖记录。 5.3内部构造 5.3.1口器 位于口面中心，由5个大而尖锐的大齿、5个大齿骨、若干块小齿骨以及与之相连肌肉束组成。 5.3.2生殖系统 雌雄异体，生殖腺5瓣，在生殖季节雄性呈淡黄色，雌性呈橙黄色。 2 SC/T2094—2020 5.3.3围口鳃 围口鳃5对，常在壳缘处形成鳃裂。 6 生长与繁殖特性 6.1生长 6.1.1实测值 人工养殖的中间球海胆的壳高、壳径和体重实测值见表1。 表1养殖中间球海胆壳高、壳径和体重实测值 月龄 壳高 壳径 体重 项目 月 mm mm g 范围 2.45~7.88 4.59~14.20 0.03~1.46 6 平均值 5.13 10.76 0. 73 标准偏差 0.97 2.34 0. 46 范围 11.55~21.98 23.34~43.95 6.34~36.34 12 平均值 16.92 33.90 15.99 标准偏差 2.06 3.67 4.87 范围 15.93~29.89 30.71~49.13 10.81~39.29 18 平均值 21.46 40.34 25.45 标准偏差 1.96 3.12 5.17 范围 22.96~33.31 42.00~52.12 33.49~59.48 22 平均值 27.91 47.58 46.10 标准偏差 2.64 2. 64 7. 99 6. 1.2 2壳径与体重的关系 壳径与体重的关系见式（1)。 BW=0.001TD2.822 (R2=0.984) (1) 式中： TD 壳径，单位为毫米（mm）； BW 体重，单位为克（g)。 6.1.3生长曲线 人工养殖的中间球海胆生长曲线见图3。 壳径，mm 体重，g 6 12 18 22年龄，月 6 12 18 22年龄，月 a）壳径生长曲线 b） 体重生长曲线 图3 中间球海胆生长曲线 6.2繁殖 6.2.1性成熟年龄 性成熟年龄为2龄。 6.2.2生物学最小型 壳径为30mm。 6.2.3繁殖期 一年一次，黄海北部地区9月上旬至10月中旬是中间球海胆的自然繁殖期，繁殖水温18℃～23℃。 3 SC/T 2094—2020 6.2.4产卵量 壳径在50mm~60mm的个体产卵量为2×10°粒~5×10°粒。 6.2.5卵子特性 卵子外观球形，卵黄均匀，外被一层透明的卵膜，属均黄沉性卵。卵径介于80μm～110μm。 7细胞遗传学特征 7.1染色体数目 染色体数目：2n=42。 7.2染色体核型 核型公式为2n=42=20m十20sm十2st。染色体核型见图4。 m sm1 1 886311 st n 10 μm a）中期分裂相 b）核型分析图 图4中间球海胆二倍体染色体及染色体组型图 8分子遗传学特征 线粒体COIDNA（细胞色素氧化酶亚基I基因)序列长度492bp，出现频率最高的单倍型序列如下： 1 CACGCCGGTG GATCTGTTGA CTTAGCGATC TTTTCCCTCC ACCTTGCCGG TGCCTCTTCT 181 TCTCTTCCAG TCTTAGCAGG AGCAATTACA ATGCTCCTCA CAGATCGTAA AATAAACACA 241 ACTTTCTTCG ATCCAGCAGG AGGAGGGGAT CCAATTCTGT TCCAACACTT ATTCTGATTT 301 TTTGGCCACC CAGAAGTGTA CATTCTTATC TTGCCTGGAT TTGGTATGAT TTCACACGTT 421 ATTGCAATAG GAGTTTTGGG ATTCCTTGTC TGAGCCCATC ATATGTTTAC GGTAGGAATG 481GATGTTGATACA 9检测方法 9.1主要生物学性状检测 9.1.1抽样方法 应按GB/T18654.2的规定执行。 9.1.2性状测量 用游标卡尺测量壳径和壳高（具体测量方法如图1），精确到0.01mm。用电子天平测量体重，精确到 0.01 g。 9.2产卵量测定 将0.5mol/L的氯化钾溶液1mL～2mL注射人性腺发育成熟的雌性中间球海胆体腔内，将海胆反 口面向下放置于盛满海水的锥形瓶瓶口，使其生殖孔浸人海水中，使卵子排出。卵子排放完成后，将卵液 玉 SC/T 2094—2020 定容。用吸管吹匀卵液，在几个不同点取等量卵液放在小烧杯中，用细胞计数法计算卵子密度。重复取样 3次以上得出卵子密度平均值，总卵量=卵液总体积卵子密度平均值。 9.3染色体和核型检测 9.3.1染色体标本的制备 a）在授精之前，将成熟卵子放置在2g/L的三氮唑中处理20min； b）用正常精子授精去膜处理后的卵子； c) 取发育至囊胚期胚胎，2000r/min离心4min，0.4g/L秋水仙素21℃水浴处理55min; d）0.075mol/L的KCl溶液低渗46min； e) f）50%冰醋酸解离，吹打2min； g) 冷滴片法滴片； h)I 自然干燥以后用10%Giemsa染液（pH=6.8)染色45min(Giemsa染液的配制方法见附录A)； i) 自来水冲洗，自然干燥后镜检。 9.3.2核型分析 按照GB/T18654.12的规定执行。 9.4分子遗传学特征 9.4.1DNA提取 取管足或齿间肌100mg剪碎后，DNA提取试剂盒或常规酚-氯仿方法提取总DNA。 9.4.2引物序列 F:5'-GAACTGGCTGAACTATCTATCCC-3'; R:5'-GAAGTACGCTCGTGTATCAACAT-3'。 9.4.3反应条件 PCR反应条件为：94℃变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延 伸5min；4℃保温。PCR扩增反应液配方见附录B。 9.4.4片段回收、纯化与测序 PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，回收纯化目的片段，测序。 10