ICS 65.120 B 46 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3475—2019 饲料中貂、狐、骆源性成分的定性检测 实时荧光PCR法 Identification of martes, fox and Nyctereutes procyonoides- originated ingredients in feeds-Real time PCR method 2019-08-01发布 2019-11-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 NY/T 3475—2019 前 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则越章。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。 。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由农业农村部畜牧兽医局提出。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76)归口。 本标准起草单位：山东省饲料质量检验所。 本标准主要起草人：冯鑫磊、李会荣、宫玲玲、李祥明、李俊玲、杨智国、朱良智。 I NY/T3475—2019 饲料中貂、狐、貉源性成分的定性检测 实时荧光PCR法 1范围 本标准规定了饲料中貂、狐和貉源性成分的实时荧光PCR法定性检测。 本标准适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料和动物源性饲料原料（动物油脂除外)中貂、狐和貉源 性成分的定性检测。 本标准的检出限为0.5%。 PUBLI 2规范性引用文件 ARD 凡是 日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版才本 （包括所有的修改单）适用手本 GB/T14699.1 饲料采样 动物饲料试样的制备 GB/T20195 GB/T27403 实验室质量 控制规范食品分子生物学检测 RA 3术语和定义 下列术语和定义 适用于 3. 1 Ct值循环阐值 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数 4缩略语 下列缩略语适用于 DNA：脱氧核糖核 RNA：核糖核酸（ribonule leicacid dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxytibonucleoside dATP：脱氧腺苷三磷酸（deoxyadenosinet osphate dCTP：脱氧胞苷三磷酸（deoxycytidinetriphosphate） dGTP：脱氧鸟苷三磷酸（deoxyguanosine hate dTTP：脱氧胸苷三磷酸（deoxythymidinetriphosphat Tris：三（羟甲基）氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（hexadecyltrimethylammoniumbromide) EDTA：乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid) Taq：水生栖热菌（thermusaquaticu） FAM：羧基荧光素（carboxyfluorescein） TAMRA：羧基四甲基罗丹明(carboxy-tetramethyl-rhodamine) ROX：6-羧基-X-罗丹明（6-carboxyl-X-rhodamine） BHQ2:black holequencher 2 JOE：2，7-二甲基-4，5-二氯-6-羧基荧光素（6-carboxy-4'，5'-dichloro-2'，7°-dimethoxyfluorescein， succinimidyl ester) 1 NY/T 3475—2019 5原理 用裂解液裂解试样中的细胞，用三氯甲烷去除蛋白等杂质，再用异丙醇沉淀得到DNA，进一步用乙醇 溶液纯化DNA。用特异性检测引物和探针对DNA进行实时荧光PCR扩增，根据扩增曲线与Ct值对试 样中貂、狐、貉源性成分进行定性检测。 6试剂或材料 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂。所有试剂溶液均用无DNA酶和RNA酶污染 的容器分装。 6.1水：符合GB/T6682规定的一级水。 6.2异丙醇。 6.3 蛋白酶 K(20 mg/mL)。 6.4 Tag DNA聚合酶(5 U/μL)。 6.5 dNTP 溶液(含 dATP、dCTP、dGTP、dTTP各 2.5 mmol/L)。 6.6 MgCl2溶液(25 mmol/L)。 6.710×PCR缓冲溶液。 6.8Tris-HCl溶液(1mol/L)：称取121.1gTris，加800mL水溶解，冷却至室温后，用浓盐酸调节溶液 的pH至8.0，加水定容至1L，121℃高压灭菌20min备用。 化钠溶液调节溶液的pH至8.0，加水定容至1L，121℃高压灭菌20min备用。 液（6.8)和20mLEDTA溶液（6.9），用水定容至1L，121℃高压灭菌20min备用。 6.11TE缓冲溶液：在800mL水中，依次加人10mLTris-HCI溶液（6.8)和2mLEDTA溶液（6.9）， 用水定容至1L，121℃高压灭菌20min备用。 6.12检测用引物和探针序列见附录A。 6.13乙醇溶液：无水乙醇十水=7十3。 6.14三氮甲烷和异戊醇混合溶液：三氯甲烷十异戊醇一24十1。 6.15基因组DNA提取试剂盒。 7仪器设备 7. 1 实时荧光 PCR仪。 7.2核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计：波长（260士1）nm，（280士1）nm。 7.3分析天平：感量0.1mg。 7.4台式离心机：转速不低于12000r/min。 7.5恒温水浴锅：65℃，精度为士1℃。 7.6高压灭菌锅。 7.7涡旋振荡器。 8样品 8.1试样的制备 按GB/T14699.1的规定，抽取有代表性的饲料样品，用四分法缩减取样。按GB/T20195的规定制 备试样，过0.15mm孔径筛后充分混匀，装人磨口瓶中备用。 2 NY/T 3475—2019 8.2对照样品的选择 以已知含有貂、狐、貉成分的样品(纯肉粉或含相应源性成分≥0.5%的饲料)为阳性对照。以已知不 含有貂、狐、貉成分的样品为阴性对照。 9试验步骤 9.1DNA提取 平行做2份试验。称取50mg试样（精确至0.1mg）于1.5mL离心管中，加入600μL～800μL CTAB裂解溶液（6.10)和20uL蛋白酶K（6.3），涡旋混匀；在（65土1）℃下水浴30min，期间每隔10min 颠倒混匀1次；12000r/min离心5min，吸取全部上清液至另一1.5mL离心管中，加人400uL三氯甲 烷和异戊醇混合溶液（6.14)，充分混匀。 9.2DNA纯化 将按9.1操作所得溶液12000r/min离心5min，吸取全部上层水溶液至另一1.5mL离心管中，加 人上层水溶液0.6倍体积的异丙醇，室温下沉淀15min～30min；12000r/min离心10min，弃上清液；加 人1mL乙醇溶液（6.13)轻缓颠倒混匀，12000r/min离心5min，弃上清液，除去残余的乙醇；待沉淀干 燥后，加人80μLTE缓冲溶液（6.11），溶解沉淀，获得试样DNA溶液，置于一20℃保存备用。 注：可用等效的基因组DNA提取试剂盒(6.15)替代9.1和9.2。 9.3对照样品处理 称取阳性对照样品和阴性对照样品各50mg（精确至0.1mg)分别置于1.5mL离心管中，按9.1~ 9.2步骤同步提取 DNA。 9.4DNA浓度的测定 准确移取5μL试样DNA溶液（9.2)加水稀释至1mL，用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计，在 260nm和280nm波长处测定吸光值A260和A280 A260/A280比值在1.7~1.9，适宜于实时荧光PCR扩增。 试样DNA溶液中DNA的浓度以质量分数计，单位为微克每微升(ug/uL)，按式(1)计算。 A260 XN× 50 (1) 1000 式中: A 260 -260nm处的吸光值； N 一试样DNA稀释倍数； 50/1000——A260为1时对应的双链DNA浓度，单位为微克每微升（μg/μL）。 在进行实时荧光PCR扩增时，需要根据所用仪器对模板DNA浓度的要求，对试样DNA溶液用水进 行稀释。 9.5检测 9.5. 1 参考 PCR 反应体系 实时荧光 PCR反应参考体系见表1。 表 1实时荧光 PCR 反应参考体系 试剂名称 添加量，μL 终浓度 10XPCR缓冲溶液 2. 5 1x 上游引物（10μumol/L，貂或狐或貉） 0. 5 0. 2 μmol/L 下游引物（10μmol/L，貂或狐或貉） 0. 5 0.2 μmol/L 探针（10μmol/L，貂或狐或貉） 0. 5 0. 2 μmol/L dNTP溶液(含 dATP、dCTP、dGTP、dTTP各 2. 5 mmol/L) 2.0 0. 2 mmol/L Taq DNA聚合酶(5U/μL) 0. 3 0. 06 U/μL MgCl2溶液(25mmol/L) 1. 2 1. 2mmol/L H20 补水至25 3 NY/T3475—2019 表1(续) 试剂名称 添加量，μL 终浓度 模板DNA 2 注：真核生物18S内参照的反应体系同上，仅以18S内参照引物和探针替换上述引物和探针。 9.5.2参考PCR扩增条件 95℃预变性10min；95℃变性10s，58℃退火35s，45个循环。 9.5.3试验对照 试验过程中，同步测定貂、狐、貉的阳性对照和阴性对照，以水为空白对照。 10质量控制 10.1PCR的有效性判定 RD 10.1.1空白对照：无貂 18S荧光信号 10. 1. 2 阴性对照：无貂 骆荧光信号 直 35.0。 10.1. 3 阳性对照：有对应貂，狐貉目的基 因荧光信号、有18S荧 形对 数曲线，Ct值≤ 35.0。 主条件否则判定P