ICS 65.120 B 46 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3473—2019 饲料中纽甜、阿力甜、阿斯巴甜、甜蜜素、 安赛蜜、糖精钠的测定 液相色谱- 串联质谱法 Determination of neotame,alitame,aspartame,sodium cyclamate, acesulfame and sodium saccharin in feeds- Liquid chromatography-tandem mass spectrometry 2019-08-01发布 2019-11-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 NY/T 3473—2019 前 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规购起章。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。 。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由农业农村部畜牧兽医局提出。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76)归口。 本标准起草单位：辽宁省兽药饲料畜产品质量安全检测中心。 本标准主要起草人：于家丰、田晓玲、郝立忠、陈玉艳、张天姝、杨慧杰、吕晓惠、李晶、纪源、孙玉飞。 NY/T3473—2019 饲料中纽甜、阿力甜、阿斯巴甜、甜蜜素、安赛蜜、 糖精钠的测定 液相色谱-串联质谱法 1范围 本标准规定了饲料中纽甜、阿力甜、阿斯巴甜、甜蜜素、安赛蜜、糖精钠的液相色谱-串联质谱测定 方法。 本标准适用于配合饲料、浓缩饲料、预混合饲料及精料补充料中纽甜、阿力甜、阿斯巴甜、甜蜜素、安赛 蜜、糖精钠的测定。 PUB 精钠的检出限为2.5mg/kg，定量限为5.0mg/kg 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于木文件 GB/T6682 分析实验室 用水规格和试验方法 GB/T20195 动物饲料 试样的制备 A 3原理 R 试样经提取后， 醋酸钻沉淀蛋白，经HILB固相萃取小柱净化后：供液相色谱-串 仪测定，基质匹 工 CENTEI 4试剂或材料 U 除非另有规定 本 4.1水：GB/T6682 4.2乙睛：色谱纯。 U 4.3饱和醋酸铅溶液：在 4.40.2%甲酸溶液：准确移取甲酸1.0mL，加水定容至500mL,混勺。 4.50.1%甲酸溶液：准确移取甲酸1.0ml.加水定容至1000mL,混勺匀 4.60.1%甲酸乙睛溶液：准确移取甲酸1.0mL，加乙定容至1000mL，混匀。 4.7纽甜（CAS号：165450-17-9）、阿力甜（CAS号： 62-3）、阿斯巴甜（CAS号：22839-47-0）、甜蜜素 （CAS号：68476-78-8）、安赛蜜（CAS号：33665-90-6）、糖精钠（CAS号：128-44-9）：纯度均不少于99.0%。 4.8标准储备溶液（1mg/mL）：准确称取对照品纽甜、阿力甜、阿斯巴甜、甜蜜素、安赛蜜、糖精钠各50 mg（精确至0.01mg)分别置于50mL容量瓶中，用0.2%甲酸溶液（4.4)溶解定容。2℃~8℃保存，有效 期6个月。 4.9标准中间溶液I（10mg/L)：移取纽甜、阿力甜、阿斯巴甜、甜蜜素、安赛蜜储备溶液（4.8)100μL置 于10mL容量瓶中，用0.2%甲酸溶液（4.4)定容，摇匀。2℃～8℃冷藏保存，有效期为3个月。 4.10标准中间溶液Ⅱ（50mg/L）：移取糖精钠储备溶液（4.8)500uL置于10mL容量瓶中，用0.2%甲 酸溶液（4.4)定容，摇匀。2℃～8℃冷藏保存，有效期为3个月。 4.11HLB固相萃取小柱：3mL/60mg，亲水亲脂平衡性的固相小柱或其他性能相当者。 4. 12 2滤膜：0.22μm，水系。 1 NY/T 3473—2019 5仪器设备 5.1液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾电离源。 5.2旋转蒸发仪。 5.3氮吹仪。 5.4离心机：转速不低于7000r/min。 5.5涡旋振荡器。 5.6超声波清洗机。 5.7天平：感量为0.000 01g和感量为 0.001 g。 6样品 按GB/T20195制备试样，全部通过0.42mm试验筛，混匀，装人密闭容器中，备用。 7试验步骤 7.1提取 平行做两份试验。称取2g（精确到0.001g)试样于50mL离心管中，准确加人0.2%甲酸溶液（4.4) 19mL和饱和醋酸铅溶液（4.3)1mL，充分振荡15min，超声提取15min，然后于7000r/min离心10 min，上清液备用。 7.2净化 固相萃取小柱依次用3mL乙腈、3mL0.2%甲酸溶液（4.4)活化。准确吸取3mL上清液(7.1)加到 小柱上，用3mL0.2%甲酸溶液（4.4)淋洗，减压抽干2min，用6mL乙腈洗脱，收集洗脱液，于50℃下旋 转蒸发或氮吹至干，准确加入0.2%甲酸溶液（4.4）3mL溶解，过0.22um滤膜后，上机测定。 7.3基质匹配标准曲线系列溶液的制备 取基质相近的空白试样，按照7.1与7.2的规定制备空白基质溶液，用标准中间溶液I和标准中间溶 液ⅡI适量，制备基质匹配标准系列。其中，糖精钠浓度为0.5mg/L、1mg/L、2.5mg/L、5mg/L、25mg/ L、50mg/L;其他浓度均为0.1mg/L、0.2mg/L、0.5mg/L、1mg/L、5mg/L、10mg/L。 7.4测定 7.4.1液相色谱参考条件 色谱柱：Cig柱，柱长100mm，内径2.1mm，粒度1.7μm，或其他性能相当者。 柱温：40℃。 进样量：5μL。 流速：0.3mL/min。 流动相：A为0.1%甲酸溶液，B为0.1%甲酸的乙腈溶液，梯度洗脱程序见表1。 表1流动相梯度条件 时间，min A,% B,% 0 S6 5 1. 0 95 5 7. 0 5 95 7. 1 95 5 10 95 5 7.4.2质谱参考条件 离子源：电喷雾离子源。 扫描方式：负离子模式。 2 NY/T 3473—2019 监测方式：多反应监测（MRM）。 毛细管电压、锥孔电压、碰撞能量等电压值应优化至最佳灵敏度。 定性离子对、定量离子对及对应的保留时间和碰撞能量见表2。 表2纟 纽甜、阿力甜、阿斯巴甜、甜蜜素、安赛蜜、糖精钠的定性离子对、 定量离子对及保留时间、碰撞电压的参考值 被测物名称 保留时间，min 定性离子对，m/2 定量离子对，m/z 碰撞能量，eV 293.2>200.2 17 阿斯巴甜 4.18 293.2>200.2 293.2>261.2 10 162.1>82.0 13 安赛蜜 1.51 162.1>82.0 162.1>77.9 20 178.1>79.9 20 甜蜜素 3.16 178.1>79.9 178.1>96.0 10 182.1>42.0 23 糖精钠 2.48 182.1>42.0 182.1>106.0 20 330.3>312.3 12 阿力甜 4. 47 330.3>312.3 330.3>167.2 20 377.4>200.1 20 纽甜 5.53 377.4>200.1 377.4>345.4 10 7.4.3定性 溶液中对应的保留时间偏差在士2.5%之内，且待测各组分定性离子的相对离子丰度与浓度接近的标准 溶液中对应的定性离子的相对离子丰度进行比较，若偏差不超过表3规定的范围，可判定为样品中存在对 应的待测物。 表3定性确证时相对离子丰度的最大允许误差 单位为百分率 相对离子丰度 >50 20～50(含） 10～20(含) ≤10 允许的最大偏差 ±20 ±25 ±30 ±50 7.4.4定量 依次测定基质匹配标准曲线系列溶液（7.3)和试样溶液，得到色谱峰面积响应值，以基质匹配标准曲 线系列溶液中被测组分峰面积为纵坐标、被测组分的浓度为横坐标，绘制工作曲线，曲线相关系数不小于 0.99。试样溶液中待测物的响应值均应在标准曲线的线性范围内，当待测物浓度不在线性范围内时，基质 匹配标准曲线与样品做相应倍数稀释，稀释倍数为n。上述条件下，纽甜、阿力甜、阿斯巴甜、甜蜜素、安赛 蜜、糖精钠标准溶液的质量色谱图参见附录A。 8试验数据处理 试样中纽甜、阿力甜、阿斯巴甜、甜蜜索、安赛蜜、糖精钠的含量以质量分数（w;）计，数值以毫克每千 克(mg/kg)表示，单点校准按式(1)计算，工作曲线校准按式(2)和式(3)计算。 A: Xc, XViXV? Wi= (1) AsiXmXV3 式中： 试样溶液中待测物的峰面积值； Asi- 标准溶液中待测物的峰面积值； 一标准溶液中待测物的浓度，单位为微克每毫升（ug/mL）； V，一一试样中加入试样提取溶液的体积，单位为毫升（mL)； 3 NY/T3473—2019 V2 一上机前试样稀释溶液的体积，单位为毫升（mL）； V3 提取液加人固相萃取小柱的体积，单位为毫升（mL)； m 试样的质量，单位为克（g）； n 试样稀释倍数。 (2) w;= (3) mXV3 式中： c 试样中待测物的含量，单位为微克每毫升（ug/mL）； Vi 试样中加入试样提取溶液的体积，单位为毫升（mL） V2 上机前试样稀释溶液的体积，单位为尾升(mB！ V3 提取液加入固相萃取 m 试样的质量 试样稀释倍数 结果保留3位有效数字 RESE 平行测定结果用算术 STA 9 精密度 CE 在重复性条件下 2次独 测试结果与其算数平士 差值不大于该平 TURA NY/T 3473—2019 附录A （资料性附录） 安赛蜜、糖精钠、甜蜜素、阿斯巴甜、阿力甜、纽甜混合标准溶液的质量色谱图 安赛