ICS 11.220 B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3468—2019 猪轮状病毒间接ELISA 抗体检测方法 Indirect enzyme-linked immunosorbent assay for detection of antibodies against porcine rotavirus 2019-08-01发布 2019-11-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 NY/T3468—2019 前 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由农业农村部畜牧兽医局提出。 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SATV/TC181)归口。 本标准起草单位：东北农业大学、中国动物卫生与流行病学中心。 本标准起草人：王丽、乔薪瑷、李一经、邵卫星、姜艳平、魏荣、王岩、李晓成、唐丽杰、崔文、孙映雪、吴 发兴。 I NY/T 3468—2019 猪轮状病毒间接ELISA抗体检测方法 1 范围 本标准规定了猪轮状病毒间接ELISA抗体检测方法的试剂、仪器和设备、试验程序、试验结果的判定 方法以及注意事项。 本标准适用于猪轮状病毒抗体检测，用于猪轮状病毒感染的流行病学调查和分析。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB19489实验室生物安全通用要求 GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫 NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 中华人民共和国农业部公告第302号兽医实验室生物安全技术管理规范 3设备和器材 3.1酶标测定仪 3.2恒温培养箱 3.3冰箱（4℃、-20℃） 3.4离心机 3.5微量移液器 量程:20 μL~200 μL、100 μL~1 000 μL。 3.6酶标板 3.7一次性注射器 量程：5mL。 4试剂 4.1猪轮状病毒VP6蛋白 VP6蛋白的表达与纯化见附录A。 4.2标准阳性血清 猪轮状病毒疫苗免疫仔猪制备，血清经病毒中和试验检测为阳性。 4.3标准阴性血清 无母源抗体、未免疫猪轮状病毒疫苗的15日龄30日龄仔猪血清。血清经病毒中和试验检测，中和 效价不大于1：4。 4.4包被液 配制见附录中的B.1。 4.5磷酸盐缓冲液(PBS液） 配制见B.2。 4.6洗涤液 配制见B.3。 4.7封闭液 1 NY/T3468—2019 配制见B.4。 4.8血清稀释液 配制见B.5。 4.9底物显色液 配制见B.6。 4.10终止液 配制见B.7。 4.11辣根过氧化物酶标记的山羊抗猪IgG、脱脂乳、TMB等 均为商品化试剂。 5血清样本的处理 PUBI HING TAND 6间接ELISA抗体检测操作方法 6.1包被抗原 将纯化的VP6蛋白用包被液稀 释至3pgm每孔100：包被酶标板，封日 8℃包被12h。 包被结束后，弃去包被液，每孔加 250止洗涤液振荡洗涤3次，每次min。 6.2封闭 L 液每孔 每孔加人封闭液250 ML置 37℃恒温箱封闭2h 封闭结束后弃去板中封闭汽 加人洗涤液 RC 8℃保存备用 6.3加样 L加人100L.同时加人 照和阳性对照血清各2孔， 将待检血清用稀释液作士：100稀释 100μ/孔。置于37℃ 培养箱中反应 C 6.4加酶标抗体 将山羊抗猪酶标抗体用抗体稀释液稀释至工作浓度,每孔加人 100L. 洗板同上。 R 6.5显色 每孔加人100μL底物显色液轻轻摇勺 37℃避光 10min 6.6终止反应 每孔加人100μL终止液终止反应。 6.7读数 在酶标仪上读取450nm吸光值（OD450 7试验结果的判定 7.1试验成立条件 在酶标测定仪上检测各孔光吸收值（OD45o），计算阳性对照平均OD45o和阴性对照平均OD450。阳性 对照血清平均OD450>0.6，阴性对照血清平均OD450<0.16，试验成立。 7.2结果判定 计算待测样品孔平均OD45o和阴性对照孔平均OD450之比。当样品孔平均OD45o（P）与阴性对照平均 OD450（N)之比不小于2.0(即P/N≥2.0)时，判定为猪轮状病毒抗体阳性；当样品孔平均OD45o（P）与阴 性对照平均ODa5o（N)之比小于2.0(即P/N<2.0)时，判定为猪轮状病毒抗体阴性。 8注意事项 8.1所有操作应严格按照GB19489和GB/T27401的规定进行。 2 NY/T3468—2019 8.2所有试剂需在2℃～8℃保存，使用前恢复至室温。 8.3操作时，注意取样或稀释准确，移液器应进行校准，并注意更换吸头。 8.4底物溶液和终止液对眼晴、皮肤及呼吸道有刺激性作用，使用过程应注意防护，防止直接接触和 吸人。 8.5底物溶液应避光保存，避免与氧化剂接触。 NY/T 3468—2019 附录A （规范性附录） 猪轮状病毒VP6蛋白的表达与纯化 A.1材料和试剂 猪轮状病毒；大肠杆菌TG1和BL21(DE3）、pMD18-T克隆载体、pET-30a表达载体、RNA提取试剂 盒、质粒提取试剂盒、反转录试剂盒、胶回收试剂盒、限制性内切酶、TaqDNA聚合酶、镍离子亲和层析柱、 MA104细胞、LB培养基、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、BCA试剂盒均为商品化试剂,PBS缓冲液。 A.2猪轮状病毒 VP6 氨基酸参考序列 MEVLYSLSKTLKDARDKIVEGTLYSNISDLIQQFNQMIVTMNGNDFQTGGIGNLPIRNWNFD FGLLGTTLLNIDANYVENARTTIEYFIDFIDNVCMDEMARESQRNGIAPQSEALRKLSGIKFKGIN FDYSCAFNAPANIQQFEHVVPLRRALTTATITLLPDAERFSFPRVINSADGATTWYFNPVIIRPSN RIESAVCESVLADASETLLANVTAVRQEYAIPVGPVFPPGMNWTELITNYSPSREDNLQRVFTVA SIRSMLIK A.3引物序列 VP6-F: 5'-GGCTTTTAAACGAAGTCTTC-3'; VP6-R:5'-GGTCACATCCTCTCACTA-3'。 A.4方法 A.4.1VP6蛋白重组原核表达载体的构建 利用RNA提取试剂盒提取猪轮状病毒的RNA，并反转录成病毒的cDNA,用引物VP6-F和VP6-R 扩增VP6基因，琼脂糖凝胶电泳并纯化回收相应的扩增片段，片段大小为1350bp。纯化产物连接 pMD18-T克隆载体，转化TG1感受态细胞，筛选获得重组阳性载体命名为pMD18-T-VP6。用Bam HI 和HindⅢ双酶切pMD18-T-VP6和pET-30a,将VP6基因片段连接到pET-30a表达载体,转化TG1感 受态细胞，筛选获得阳性重组载体命名为pET-30a-VP6。 A.4.2VP6蛋白的表达与纯化 将pET-30a-VP6转化BL21(DE3)感受态细胞，筛选获得含有重组载体的阳性菌株。将阳性重组菌 接种至20mL含有10μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养，待菌液OD值达到0.5左右，加 人终浓度为1mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导,37℃振荡培养4h。4000r/min离 心收集菌体，PBS重悬，超声裂解，12000r/min4℃离心10min，取上清液。按照镍离子亲和层析柱的说 明书纯化VP6蛋白，目的蛋白大小约为45ku。 A.4.3重组蛋白纯度及浓度测定 分别取5μL、2.5μL和1μL纯化的重组蛋白进行SDS-PAGE电泳，用凝胶成像仪成像并用薄层扫 描法测定蛋白纯度，蛋白纯度应不小于90%。同时利用BCA法测定蛋白浓度，纯化后蛋白浓度应不小于 0. 1 mg/mL. 4 NY/T3468—2019 附录B (规范性附录） 溶液配制 B.1包被液(0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH9.6) 1.59 g 碳酸钠（Na2CO3，分析纯） 碳酸氢钠（NaHCO3，分析纯） 2.93 g 纯化水 加至1000mL 溶解后，调节pH至9.6，4 B. 2 PBS液(0.01mol/L 析 0.2 g 磷酸二氢钾(KH2P 磷酸氢二钠（Na2HPO 2. 9 g S 氯化钠(NaCI,分析纯） 0g 0. 2g 氯化钾（KCI,分析纯） A 纯化水 00 mL n保 溶解后，调节pH至 7 存于4℃备用。 B.3 PBS 000 mL 吐温-20（分析纯） 5mL 混匀后，调节pH至 B.4封闭液 脱脂乳5g，加PBST定容至 见用现酉 B.5 血清稀释液 同B.4封闭液。 B.6底物显色液（TMB-过氧化氢尿素溶液） B.6.1底物液A 200 mg TMB（分析纯） 无水乙醇或DMSO 100ml 蒸馏水 加至1000mL B.6.2底物缓冲液B 71.7 g 磷酸氢二钠（Na2HPO·12HO，分析纯） 9.33 g 柠檬酸（分析纯) 0.75%过氧化氢尿素 6.4 mL 蒸馏水 加至1000mL，pH调至5.0~5.4。 B.6.3将底物A液和底物缓冲液按1：1混合，即成底物显色液，现用现配。 5