ICS 11.220 B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3465—2019 山羊关节炎脑炎诊断技术 Diagnostic techniques for caprine arthritis-encephalitis 2019-08-01发布 2019-11-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 NY/T 3465—2019 前 V 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 X 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。 本标准起草单位：中国动物疫病预防控制中心、中国农业科学院兰州兽医研究所、天津大学、重庆市动 物疫病预防控制中心 本标准主要起草人：宋晓晖、孙雨、张志东、黄金海、肖颖、窦永喜、曲萍、胡冬梅、王传彬、杨林。 I NY/T 34652019 引言 山羊关节炎脑炎（Caprinearthritis-encephalitis，CAE）是由反转录病毒科慢病毒属山羊关节炎脑炎病 毒（CAEviruS，CAEV)引起的一种慢性进行性传染病。CAEV感染引起肺脏、关节、乳房以及中枢神经系 统的进行性单核细胞炎症损伤，临床上羔羊发生脑脊髓炎，成年山羊发生多发性关节炎、间质性肺炎和乳 房炎。山羊关节炎脑炎常呈亚临床感染，但可通过初乳、乳汁或者呼吸道分泌物持续传播病毒。世界动物 卫生组织（WorldOrganisationforAnimalHealth，OIE)将山羊关节炎脑炎列为必须报告的动物疫病，我 国《一、二、三类动物疫病病种名录》将其列为二类动物疫病。梅迪-维斯纳病和山羊关节炎脑炎都是小反 兽慢病毒病，两种病原在系统发育上存在密切相关性，临床上山羊关节炎脑炎只感染山羊，以关节炎最 常见，梅迪-维斯纳病感染绵羊，以慢性进行性肺炎最常见。 本标准参考了OIE《陆生动物诊断试剂和疫苗使用手册》的有关内容，技术方法与OIE推荐的标准方 法一致。其中，病毒分离适用于从活体动物的乳汁、关节囊液或外周血液中以及从死亡动物的肺、滑膜或 乳腺组织中分离CAEV,可用于临床诊断；聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR)适用于检 测病毒核酸，可用于对前病毒DNA的检测；酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay， ELISA)适用于检测血清样品中的CAEV抗体，可用于临床诊断、流行病学调查、检验检疫；琼脂免疫扩散 试验（AgarGelImmunodiffusion，AGID)适用于检测血清样品中的CAEV抗体，可用于临床诊断、流行病 学调查、检验检疫。 Ⅱ NY/T 3465—2019 山羊关节炎脑炎诊断技术 1 范围 本标准规定了山羊关节炎脑炎的临床诊断、病原分离与鉴定、病原核酸检测以及血清学检测的技 术要求。 本标准适用于山羊关节炎脑炎的临床诊断、实验室检测以及检验检疫。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3临床诊断 3.1 流行病学 3.1.1易感动物 在自然条件下，山羊最易感，偶见绵羊发病。山羊易感性不受性别和年龄影响。 3.1.2传染源 病羊和隐性感染羊是主要传染源。 3.1.3传播途径 羔羊吸感染山羊的初乳或奶是主要的传播途径，也可通过被病羊分泌物与排泄物污染的饲草、饲 料、饮水传播，还可通过免疫治疗、人工授精器械、挤奶器械等传播。 3.2临床症状 3.2.1脑脊髓炎 2月龄～6月龄羔羊常见脑脊髓炎，偶见于青年羊和成年羊。感染早期病羊表现虚弱、共济失调和后 肢站立不稳，也可见反射亢进和肌张力亢进，继而发展为后肢轻瘫、四肢软弱和瘫痪，也可见沉郁、头部歪 斜、转圈运动、角弓反张、斜颈和划水样等神经症状。 3.2.2关节炎 成年羊多见，病羊关节囊肿胀，关节最常见，伴有不同程度的跛行。 3.2.3肺炎 病羊可见呼吸困难，偶见干咳；也可见食欲下降，精神不振，体重减轻。 3.2.4乳房炎 病羊分娩后乳腺肿胀、坚硬，无乳，产奶量低下。 3.3结果判定 山羊出现上述临床症状之一，可判定为山羊关节炎脑炎疑似病例。 4病理诊断 4.1脑脊髓炎 剖检可见脑脊髓出现不对称分布、颜色呈淡褐色的肿胀；病理组织学可见脑和脊髓出现多处单核细胞 浸润的炎性病灶，伴有不同程度的脱髓鞘。 1 NY/T3465—2019 4.2关节炎 剖检可见关节囊增厚和滑膜绒膜明显增生，也可见关节囊、腱鞘和黏液囊软组织钙化，严重病例可见 软骨损伤、韧带和肌腱断裂、关节周围形成骨刺。病理组织学可见滑膜细胞增生，滑膜下单核细胞浸润，绒 毛过度增生、滑膜水肿和滑膜坏死。 4.3肺炎 剖检可见肺脏坚实、呈暗红色，有白色病灶。支气管淋巴结可见肿胀。病理组织学可见肺泡隔膜、支 气管及周围组织的淋巴细胞浸润。 4.4乳房炎 病理组织学可见乳导管基质周围单核细胞浸润，正常结构不清晰，并出现坏死灶。 4.5结果判定 5病原学方法 5.1病原分离与鉴定 5.1.1试剂耗材 除特殊说明外，本标准使用的化学试剂均为分析纯：永均为符合红6682 5.1.1.1细胞生长液（配制方法见附录A中的） 5. 1. 1.2 细胞维持液（配制方法质 A2) 3Hank's平衡盐溶液。 5. 1. 1. 3 5.1.1.4 细胞消化液（配 配制方法见A.3月 5. 1. 1.5 青霉素、链霉雾 5. 1. 1. 6 山羊滑膜 membrane 去见附录B) synpvia 5. 1. 1. 7 肺泡巨噬细胞 制备方 5.1. 1. 8 细胞培养瓶 5. 1. 1. 9 灭菌吸管（5 10 ml 200100p-1000) 以及相应 应吸头。 5. 1. 1. 10 微量可调移液器 5. 1. 1. 11 抗凝真空采血 5. 1. 1. 12 聚四氟乙烯袋。 5. 1. 2 仪器设备 5. 1. 2. 1 二氧化碳培养箱。 5. 1. 2. 2 普通冰箱（2℃~8℃）、低温冰箱（ 20℃) 5. 1. 2. 3 倒置生物显微镜。 5.1.2.4 二级生物安全柜。 5. 1.2.5 超净工作台。 5.1.2.6通用离心机。 5.1.3样品 无菌采集疑似感染羊的乳汁、外周血或者关节囊液样品，或剖检无菌采集病羊新鲜肺脏、关节滑膜、乳 房等组织样品。样品采集、保存、运输按照NY/T541的规定进行。 5.1.4试验步骤 5.1.4.1样品处理 5.1.4.1.1提取白细胞 乳汁、外周血或者关节囊液样品用商品化提取液提取白细胞，用细胞生长液将白细胞制成约6×108 2 NY/T 3465—2019 个细胞/mL的悬液。将细胞悬液加人到聚四氟乙烯袋中，37℃、5%CO2条件下，培养10d～12d。 5.1.4.1.2培养组织细胞 组织样品置于含适量细胞生长液的培养血中，用手术剪充分剪碎，用巴氏管吸取转移单个组织碎片至 25cm²细胞培养瓶中，每瓶放置20个～30个组织碎片。在每个碎片上滴加一滴细胞生长液后，37℃、5% CO2条件下，静置培养3d～4d,使组织碎片增殖贴壁。待培养瓶中的组织片贴壁后，补加培养液，使细胞 增殖，用胰酶消化后分瓶培养并形成单层细胞。 5.1.4.1.3制备肺泡巨噬细胞 肺脏可按附录C的方法制备肺泡巨噬细胞。 5.1.4.2与指示细胞 GSM共培养 GSM单层细胞用细胞维持液洗2次，加人2mL~5mL按照5.1.4.1.1、5.1.4.1.2、5.1.4.1.3方法 制备的细胞，补齐细胞培养液至5mL，37℃、5%COz的条件下培养。 5.1.4.3结果观察 连续培养观察5周，CAEV感染细胞典型细胞病变为形成合胞体细胞，每个合胞体细胞中含有2个～20 个细胞核，以合胞体细胞为中心，周围是遮光性强的梭形细胞。观察期间应根据细胞生长状况换液和传代。 5.1.4.4病毒的鉴定 出现5.1.4.3典型细胞病变后，应制备细胞培养飞片（操作方法见附录D)，并采用间接免疫荧光抗体 技术(操作方法见附录E)或电镜技术鉴定并确认。 5.1.4.5结果判定 阳性：活体组织、剖检组织或肺泡巨噬细胞同指示细胞GSM共培养后，细胞出现CAEV典型病变，并 且经间接免疫荧光抗体染色，细胞培养飞片同阳性血清有荧光反应，或者电镜观察到直径为80nm～ 120nm、表面有长的纤突、核心致密位于粒子的中央、呈棒状或钝圆锥状的典型的慢病毒粒子，则判定为 山羊关节炎脑炎病毒分离阳性，表述为检出山羊关节炎脑炎病毒。 阴性：活体组织、剖检组织或肺泡巨噬细胞与指示细胞GSM共培养后，细胞没有CAEV典型病变，并 且经间接免疫荧光抗体染色，细胞培养飞片与阳性血清没有荧光反应，或者电镜没有观察到典型的慢病毒 粒子，则判定为山羊关节炎脑炎病毒分离阴性，表述为未检出山羊关节炎脑炎病毒。 5.2 PCR方法 5.2.1试剂耗材 5.2.1.1DNA提取试剂盒。 5. 2. 1. 2Ficoll Pague PLUS. 5.2.1.32XTaq buffer反应液。 5.2.1.410XPCR反应液。 5. 2. 1. 5 DL 2 000 plus DNA Marker。 5.2.1.61%琼脂糖(配制方法见附录F)。 5.2.1.75XTBE缓冲液（配制方法见附录F)。 5.2.1.8 引物 检测引物及序列参见附录G,引物用DEPC水配成100μmol/L的储存液和10μmol/L的工作液。 5.2.1.9对照样品 阳性对照：