ICS 11.220 B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3464—2019 牛泰勒虫病诊断技术 Diagnostic techniques for bovine theileriosis 2019-08-01发布 2019-11-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 NY/T3464—2019 前 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起算。 本标准由农业农村部畜牧兽医局提出 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。 本标准起草单位：中国农业科学院兰州兽医研究所。 本标准主要起草人：罗建勋、刘军龙、关贵全、殷宏、刘爱红、李有全 I NY/T 3464—2019 牛泰勒虫病诊断技术 1 范围 本标准规定了环形泰勒虫和瑟氏泰勒虫的检测技术及其所引起的牛泰勒虫病的诊断技术要求。 本标准适用于牛泰勒虫病病原检测及急性临床病例的诊断。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 PBS:磷酸盐缓冲液(phosphatebuffersolution)） PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction） 4材料与试剂 4.1试剂 4.1.1除特别规定外，在检测中使用的试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682的要求。 4.1.2姬姆萨(Giemsa)染色液原液（见附录A中的A.1)。 4.1.3姬姆萨染色液工作液（见A.2）。 4.1.4甲醇。 4.1.5香柏油。 4.1.62XPremixTag酶混合液（商用)：包含DNA聚合酶、缓冲液和2.5mmol/L的dNTP混合物。 4.1.7 无RNase水。 4.1.8 全血基因组提取试剂盒。 4.1.9琼脂糖（电泳级）。 4. 1.10 1XTAE(见A.3)。 4.1.1110mg/mL溴化乙锭(EB)或同类核酸染料（见A.4)。 4.1.12环形泰勒虫阳性对照（用环形泰勒虫感染牛，染虫率达到5%以上时，提取血液基因组DNA，稀 释至 1 ng/μL)。 4.1.13瑟氏泰勒虫阳性对照（用瑟氏泰勒虫感染牛，染虫率达到5%以上时，提取血液基因组DNA，稀 释至 1 ng/μL)。 4.1.14泰勒虫阴性对照（筛选泰勒虫阴性牛，提取血液基因组DNA,稀释至1ng/μL)。 4.2耗材 4.2.1载玻片。 4.2.2抗凝真空采血管。 4.2.3剪毛剪。 4.2.41.5mL无菌离心管。 1 NY/T3464—2019 4.2.5200μLPCR管。 4.3仪器 4.3.1光学显微镜（含100×物镜）。 4.3.2PCR扩增仪。 4.3.3核酸电泳系统。 4.3.4 凝胶成像仪。 4.3.5单道微量移液器（1μL~10μL；10μL~100μ;100μ~1000μL）。 4.3. 6 高速离心机。 生物安全要求 定执行。 6 临床诊断 6. 1 典型临床症 6. 1. 1 稽留热 本温 准持化 6. 1.2 眼结膜 中胀，可 黏膜 6.1.3浅表淋 告肿胀， 地坚硬触 6.1.4 贫血 淡黄战 A 6.2典型病理变 化 6.2.1血液 6.2.2体表淋 的上 肿胀 6.2.3皱胃黍 或溃疡 见B2)。 CENT 6.3流行特点 ICU 6.3.1多发 6.3.2患病动物 6.3.31岁~3 种和改良生常出 床症状。 6.4结果判定 牛只出现6.1和 的变化 勒虫病 7 血涂片显微镜检查 7.1血涂片制备 用剪毛剪剪除牛耳尖牛毛，针头刺破耳尖·挤取 滴耳尖静脉血于玻片上，用推片推成有末梢的薄血 涂片，并迅速晾干。 7.2血涂片固定 加3滴甲醇于血涂片上进行固定，晾干后重复一次。 7.3血涂片染色 将姬姆萨染液工作液滴加到甲醇固定好的血涂片上，室温染色30min后，用自来水充分冲洗掉残留 的染色颗粒，吹风机吹干或自然晾干后待检。 7.4显微镜检查 血涂片上滴加一滴香柏油，在1000倍（10×100)光学显微镜下观察100个视野。 7.5结果判定 7.5.1阳性：红细胞内观察到泰勒虫典型虫体时，可确诊(参见附录D)。 2 NY/T 3464—2019 7.5.2疑似：红细胞内未见典型虫体，仅观察到少量点状或不规则形颗粒，判定为疑似感染。 7.5.3阴性：未出现7.5.1和7.5.2的结果，判定为血涂片检测阴性。 8环形泰勒虫和瑟氏泰勒虫PCR检测方法 采用多重PCR方法从待检牛血液基因组中检测环形泰勒虫COB特异性基因片段和瑟氏泰勒虫转录 间隔区(ITS)特异性基因片段。 8.1病原DNA制备 采集待检牛颈静脉抗凝血，用商品化的血液基因组DNA提取试剂盒提取虫体DNA，提取步骤按照 说明书进行。提取好的虫体DNA立即进行PCR扩增或一20℃保存备用。 8.2PCR反应操作方法 8.2.1反应体系 按照附录E，用引物AnCb-F/AnCb-R和SerITS-F/SerITS-R(见附录F)组合配置PCR反应体系，反 应体系为25μL。环形泰勒虫阳性对照模板为4.1.12所列环形泰勒虫DNA2μL；瑟氏泰勒虫阳性对照 模板为4.1.13所列瑟氏泰勒虫基因组DNA2μL；阴性对照模板为4.1.14所列泰勒虫阴性感染牛血液 基因组 DNA 2 μL。 8.2.2PCR 反应条件 反应体系配置并混匀后，置于PCR仪内进行扩增。扩增程序为：95℃预变性5min；94℃变性 1min，61.5℃退火50s，68℃延伸1min，共35个循环；68℃延伸10min。 8.2.3PCR产物琼脂糖凝胶电泳及成像 用1×TAE缓冲溶液配制1.5%琼脂糖凝胶，取PCR产物10μL在1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳，凝 胶成像分析系统观察结果并拍照。 8.2.4质控标准 环形泰勒虫阳性对照出现393bp、瑟氏泰勒虫阳性对照出现818bp的特异性条带，阴性对照无扩增 条带时，判为实验有效。 8.3结果判定 8.3.1阳性 与DNA标准分子量比对，当样品出现大小为393bp扩增片段时，判定为环形泰勒虫核酸阳性；当样 品扩增片段大小为818bp时，判定为瑟氏泰勒虫核酸阳性（见附录G）。 8.3.2阴性 样品无特异性的阳性扩增条带出现，判定为环形泰勒虫和瑟氏泰勒虫核酸阴性。 9综合判定 9.1 阳性 同时出现6.1、6.2、6.3，同时出现7.5.1或8.3.1，判定为泰勒虫病阳性。 9.2隐性感染 未出现6.1、6.2和6.3，但出现7.5.1或8.3.1时，判定为泰勒虫隐性感染。 9.3阴性 未出现6.1、6.2和6.3，同时出现7.5.3和8.3.2时，判定为牛泰勒虫病阴性。 3 NY/T 3464-2019 附录A （规范性附录） 标准中涉及的试剂配制方法 A.1姬姆萨染液原液 姬姆萨染料0.5g，甘油33mL，甲醇33mL。将染料置于研钵中，加少量甘油进行充分研磨后，加人 全部甘油，55℃～60℃水浴加热1h～2h，期间不断摇动混匀。冷却至室温后加入甲醇，储存在棕色瓶中 室温静置6个月～12个月，过滤备用。 A.2姬姆萨染色液工作液 按每毫升无离子水加200μL姬姆萨染色液原液进行配置。 A.3电泳缓冲液的配置（TAE） 50XTAE储存液： Tris-Base 242 g Na2EDTA · 2H20 37.2 g 冰醋酸 57.1 mL 加双蒸水800mL溶解，充分混匀后加双蒸水补齐至1000mL。 1×TAE工作液：取10mL储存液加490mL双蒸水，即为1×TAE工作液。 A.410mg/mL溴化乙锭 称取溴化乙锭1g，加蒸馏水定容至100mL，磁力搅拌充分溶解后，棕色瓶内室温保存。 A.51.5%琼脂糖凝胶板配置 琼脂糖 1.5 g 1XTAE电泳缓冲液 100 mL 将琼脂糖放人TAE电泳缓冲液中，加热融化，温度降至60℃时，加人溴化乙锭或同类型核酸染料 10μL，混匀后铺板。 NY/T3464—2019 附录B （资料性附录） 泰勒虫病典型病理图片 B.1感染泰勒虫后淋巴结肿胀，见图B.1。 图B.1淋巴结肿胀 (引自AnamikaG.，etal.，2017) B.2感染泰勒虫后，牛皱胃肿胀并出现溃疡，见图B.2。 图B.2皱胃肿胀并出现溃疡 (引自OryanA.，etal.，2013)