ICS 11.220 B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3463—2019 禽组织滴虫病诊断技术 Diagnostic techniques for histomoniasis 2019-08-01发布 2019-11-01实施 中华人民共和国农业农村部发布 NY/T3463—2019 前 本标准由农业农村部畜牧兽医局提出。 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC 181）归口。 本标准起草单位：扬州大学。 本标准主要起草人：许金俊、孔令明、陶建平、秦爱建、刘丹丹、侯照峰、宿世杰、曲昌宝、振男、郭平、 王子静、陈乔光、戎杰。 I NY/T3463—2019 引言 leagridis)感染鸡形目禽类所导致的以肝脏坏死和盲肠肿大为主要临床特征的寄生虫病。近年来，随着家 庭农场、生态放养及圈养模式的示范推广，该病在我国地面平养、放养和散养鸡群中流行普遍，造成严重的 经济损失。为做到组织滴虫病的早期诊断，从而避免给养殖业造成经济损失，同时为避免未知新基因型虫 体引人我国甚至导致贸易纠纷，特制定本标准。 NY/T 3463—2019 禽离组织滴虫病诊断技术 1 范围 本标准规定了禽组织滴虫病临床诊断和实验室诊断（组织脏器中病原的体外分离培养与镜检；分离的 本标准适用于禽组织滴虫病的诊断和检疫。其中，临床诊断、病原的分离培养、分离的虫体及组织脏 器中病原PCR检测方法适用于组织滴虫病的诊断，泄殖腔内容物中病原的PCR检测方法适用于组织滴 虫病的流行病学调查及检疫。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫 NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3. 1 火鸡组织滴虫Histomonasmeleagridis，H.meleagridis 原生动物界肉足鞭毛门鞭毛虫亚门动鞭毛虫纲毛滴目单尾滴虫科组织滴虫属的原虫。 3. 2 组织滴虫病histomoniasis 盲肠肝炎或黑头病 由火鸡组织滴虫引起的鸡形目禽类的以肝脏坏死和育肠肿大为特征的寄生虫病。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid） dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleosidetriphosphate） PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction） Taq 酶:TaqDNA聚合酶(Taq DNA polymerase) 5临床诊断 5.1流行特点 5.1.1鸡形目禽类火鸡、鸡、孔雀、鹑、野鸭、鹧鸪、驼鸟、珍珠鸡等均可感染，火鸡最为易感。 5.1.2维禽如4周龄～6周龄的维鸡、3周龄～12周龄的维火鸡感染后易发病死亡，成年禽症状不明显 死亡率低。 5.1.3潜伏期一般15d～21d,病程1周～3周,死亡率可达50%～85%。 5.1.4地面平养、放养和散养的禽群多发，温暖潮湿的季节多发。 1 NY/T 3463—2019 5. 2 临床症状 5.2.1病禽缩头、垂翅、羽毛松乱，排黄绿色的恶臭稀粪。 5.2.2急性严重的病禽粪便带血或排泄物全是血液。 5.2.3部分病禽的头部皮肤发。 5.3病理变化 5.3.1肝脏肿大，典型病变为表面呈现黄绿色、中心凹陷且边缘隆起似火山口样的圆形坏死灶，单独存 在或融合成片状（参见附录A中的图A.1)，少数病例坏死灶呈现点状。 5.3.2盲肠一侧或两侧肿胀，肠壁肥厚，肠腔内形成干酪状的肠芯（参见图A.2)。 5.4结果判定 符合5.1流行特点，病禽出现5.2中任何一种临床症状和/或5.3中的任何一种病理变化，可判为疑 似组织滴虫病，应进行实验室确诊。 6 实验室诊断 以下实验室诊断过程中，实验用水的要求按照GB/T6682中一级水的要求执行，实验室生物安全要 求按照GB19489的规定执行；涉及动物的要求按照GB/T27401的规定执行；涉及诊断样品采集、保存和 运输的要求按照NY/T541的规定执行。 6.1病原分离鉴定 6.1.1试剂 6.1.1.1Medium199(1X)基础培养基。 6.1.1.2 马血清。 6.1.1.3胎牛血清。 6.1.1.4 米粉。 6.1.1.5哥伦比亚血琼脂平板。 6.1.1.6青霉素。 6.1.1.7链霉素。 6.1.1.8两性霉素B。 6.1.1.9灭菌生理盐水:0.9%NaCl。 6.1.2耗材 6.1.2.1手术剪刀。 6.1.2.2镊子。 6.1.2.3接种环。 6.1.2.4细菌培养皿。 6.1.2.5细胞培养瓶。 6.1.2.6 EP管:1.5mL。 6.1.2.7蜡烛。 6.1.2.8载玻片。 6.1.2.9盖玻片。 6.1.3仪器 6.1.3.1 电子天平：1 mg~520 g。 6. 1. 3. 2 微量移液器:0. 2 μL~2 μL、2 μL~10 μL、10 μL~100 μL、20 μL~200 μL、100 μL~1 000 μL, 并配备与之匹配的枪头。 6.1.3.3无菌操作台。 2 NY/T3463—2019 6.1.3.4隔水式电热恒温培养箱。 6.1.3.5可密封的烛缸。 6.1.3.6普通光学显微镜 6.1.3.7相差显微镜（有条件时选用，非必备） 6.1.4病原分离 可选下列1种或2种样品分离病原： a) 盲肠中虫体的分离：有条件时，在分离培养之前先直接镜检有无虫体。步骤如下：取病鸡的新鲜 盲肠内容物.用40℃生理盐水制成县 即放到相差显微镜下镜检。虫体分离时，取5g~ 10g病禽盲肠内容物及盲肠壁刮取物至含9mL的M199培养基的细胞瓶中，加人米粉11mg、 终浓度为15%的胎牛 血清、终浓度 2001U 的青霉素 冬浓度为200μg/mL的链霉素、终 培养箱 中，于烛缸中进行厌氧培养， 48h~72h后 观察培 b) 肝脏虫体的 培养，在兄菌 茶 脏的 g，放人无菌的1.5mL EP管中 99 瓶中如人 m 米粉，终浓度为10% 的马血 接种环 康鸡的盲 的盲肠细菌。 育肠细菌 其盲肠内容物无菌 接种于 比衣血 脂平板坊羊基王 7℃ 杭温 人箱中培 得 培养瓶放入烛缸 中，点 燃蜡 烛 放 恒温培养 箱 48.h 察 音养 结果。 6.1.5病原镜 m 检 分别取6 中 光学显微镜下 R 观察有无虫体 6.1.6结果判 盲肠内容 M199培养基中 生长的火鸡组 虫呈园 本直径 um~20μm，运 动缓慢微弱呈 样口 6.2聚合酶链 应DP 6.2.1试剂 R 6.2.1.1除另有 6.2.1.2灭菌生理 :09 6.2.1.3基因组DNX 是取试剂盒 6.2.1.4 TaqDNA聚合 5U/ul iMg PCR缓冲液 6.2. 1.5 dNTP Mixture:2. ol/L。 6.2. 1.6 DL20ooDNAMarke 6.2.1.7 电泳级琼脂糖。 6. 2. 1. 8 31XTAE电泳缓冲液，配置方法见附录C。 6.2. 1.9 琼脂糖凝胶电泳加样缓冲液：6XDNALoadingBuffer。 6. 2. 1. 10 溴化乙锭。 6.2.1.11阳性对照：组织滴虫病鸡肝脏、阳性、含虫体的培养液；阴性对照：SPF鸡肝脏、盲肠和不含虫 体的培养液。 6.2.2耗材 6.2.2.1手术剪刀。 6.2.2.2镊子。 6.2.2.3EP管：1.5mL。 3 NY/T 3463—2019 6.2.2. 4 一次性注射器:50 mL、20 mL、10 mL、5 mL、2 mL、1 mL。 6.2.2.5 PCR管:200 μL。 6.2.3仪器 6.2.3.1电子天平：1mg~520g。 6.2.3.2 pH计。 6. 2. 3. 3 微量移液器:0. 2 μL~2 μL、2 μL~10 μL、10 μL~100 μL、20 μL~200 μL、100 μL~1 000 μL, 并配备与之匹配的枪头。 6.2.3.4手持式电动组织匀浆器。 6.2.3.5小型高速离心机：最大离心速度在12000r/min以上。 6.2.3.6恒温水浴锅。 6.2.3.7涡旋仪。 6.2.3.8PCR扩增仪。 6.2.3.9微波炉。 6.2.3.10核酸电泳仪。 6.2.3.11凝胶成像仪。 6.2.4引物 用于火鸡组织滴虫特异性18SrRNA基因扩增的引物序列和扩增产物大小见附录D中的表D.1。 6.2.5样品采集 样品的采集选择下列1种、2种或3种： a）分离的虫体：将培养的含有虫体的培养液吸取1.5mL到灭菌的EP管中，然后在3000r/min离 心5min，弃去上清液，取沉淀物一20℃冻存，作为待检样品； b) 组织器官：用灭菌眼科剪采集禽类的肝脏或盲肠，每份100mg，标记后放入1.5ml离心管，用 眼科剪剪碎组织，匀浆器匀浆，一20℃冻存，作为待检样品； c） 泄殖腔内容物：用1.0mL以上的注射器，将2mL的40℃灭菌生理盐水注入禽类泄殖腔，以洗 涤泄殖腔，然后将洗涤液收集于1.5mL离心管中，以3000r/min离心沉淀5min后，弃去上清 液，取沉淀物一20℃冻存，作为待检样品。 6.2.6PCR模板的制备 按商品化的DNA提取试剂盒说明书的方法提取6.2.5中a）和/或b）和/或c）样品以及阳性和阴性 对照样品的基因组DNA模板。 6.