ICS 65.020.30 B 43 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3446—2019 奶牛短脊椎畸形综合征检测 PCR法 Detection of brachyspina syndrome in dairy cattlePCR method 2019-08-01发布 2019-11-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 NY/T 3446—2019 前 V JV 本标准由农业农村部畜牧兽医局提出。 本标准由全国畜牧业标准化技术委员会(SAC/TCV274)归口。 本标准起草单位：农业农村部牛冷冻精液质量监督检验测试中心（北京）、北京奶牛中心、中国农业大 学、农业农村部种畜品质监督检验测试中心、农业农村部牛冷冻精液质量监督检验测试中心（南京）、全国 畜牧总站。 本标准起草人：张晓霞、李艳华、麻柱、刘林、张胜利、房灵昭、韩广文、薛建华、钟代彬、刘丑生、陆汉希、 李姣。 I NY/T3446—2019 奶牛短脊椎畸形综合征检测 PCR 法 1范围 本标准规定了奶牛短脊椎畸形综合征的PCR检测方法。 本标准适用于奶牛短脊椎畸形综合征基因型的分子检测与诊断。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 GB/T27642牛个体及亲子鉴定微卫星IDNA法B 3术语和定义 RE 3. 1 短脊椎综合征 brachyspina syndrome,BS 在荷斯坦牛群中发现的隐性遗传缺陷疾病，当缺陷等位基内纯合时才会 缩短，胎儿在妊娠后期流产 fanconi anemia complementation-grour 1 基因2527外显子缺失引起的缺失长度3 329Bp（BTA21:21184870- RCH 21188198)。 R U 4原理 针对FANC 基因缺失的2527外显子，在缺失片段两侧 勿，进行长片段PCR 扩增，根据PCR产 物大小判定个体基因型 5PCR引物 引物 BSR:5'-ATAAATA- AATAAAGCAGGATCCTGAAA3 预期扩增片段长度：3738bp/409bp。 图A.1。 6试剂和材料 除非另有说明，在试验中仅使用确认为分析纯的试剂或蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。 6.1长片段TaqDNA聚合酶 6.210×PCR缓冲液（含Mg2+） 6.3dNTPs（dATP、dCTP、dGTP、dTTP4种溶液的等比例混合液） 6.4DNA分子量标记 6.5核酸染料 6.6琼脂糖 6.775%乙醇 6.850×TAE缓冲液 取Tris碱242g，冰乙酸57.1mL,0.5mol/LEDTA(pH8.0)100mL，加水定容至1000mL，室温 保存。 1 NY/T 3446—2019 7仪器设备 7.1PCR扩增仪 7.2凝胶成像分析系统 7.3电泳仪 7.4水平电泳槽 7.5可调移液器 7.6离心机 7.7干式加热器(或水浴锅) 7.8电子天平 8样品 8.1样品准备 收集牛血液（新鲜或抗凝血）、组织（耳组织、肌肉、尾组织、皮肤等）、带毛囊的牛毛、精液等试验材料。 血液、精液、组织样品一20℃及以下低温保存备用；带毛囊的毛发浸入75%乙醇中一20℃及以下低温保存 备用。 8.2DNA提取 按GB/T27642规定的方法执行。 9试验步骤 9.1PCR扩增 9.1.1 PCR 反应体系 DNA模板50ng～100ng，长片段TaqDNA聚合酶1.5U,加水至25μL。 9.1.2PCR反应程序 94℃预变性5min;94℃变性30s，58℃退火1min，72℃延伸2.5min，35个循环；72℃聚合延伸10min， 4℃保存。 9.2电泳检测 9.2.12.0%琼脂糖凝胶制备 称取2g琼脂糖，加100mL1×TAE煮沸，等温度降至50℃～60℃时，加人核酸染料或其他替代物。 9.2.2上样电泳 取5μLPCR扩增产物，上样于2.0%琼脂糖凝胶中进行电泳（3V/cm5V/cm，电泳1.0h～1.5h）， 在凝胶成像系统中观察电泳条带。 10试验数据处理 10.1正常个体 仅扩增出一条长3738bp的PCR产物，基因型命名为AA型。 10.2BS隐性携带者 同时扩增出长3738bp和409bp的PCR产物，基因型命名为AB型。 10.3 BS 患病牛 仅扩增出一条长409bp的PCR产物，基因型命名为BB型。 PCR检测结果示意图参见图A.2。 2 NY/T3446—2019 附录A (资料性附录) PCR引物位置和BS检测结果示意图 A.1引物位置示意图 见图A.1。 3738 bp 3329bp 230 bp 缺失 179 bp 野生型 Exon24 Exon25 Exo1128 上游引 下游引 物位点 物位点 突变型 Exon24-0- 1-0-Exon28 409 bp 图A.1 FANC1基因中引物位置示意图 A.2 2BS检测结果示意图 见图A.2。 M1 1 2 3 4 5 6 M2 4 kh, 3 738 bp 3kb 2 kh - 1 kb 622 bp 527bp 409 bp b 404 bp 309bp 说明： M1 1kbDNALadder分子量标记； 2- 一BS隐性携带者基因型（AB型）； M2 pBR322/MspIDNAMarker分子量标记； 5——阳性对照； 1、3、4- 正常个体基因型（AA型）； 6 一空白对照。 图A.2 FANC1基因PCR检测结果示意图 3 NY/T 3446—2019 全国农业食品标准 农业行业标准 奶牛短脊椎畸形综合征检测PCR法 NY/T3446—2019 中国农业出版社出版 （北京市朝阳区麦子店街18号楼） （邮政编码：100125 网址：www.ccap.com.cn) 北京印刷一厂印刷 新华书店北京发行所发行各地新华书店经销 * * 开本880mm×1230mm1/16 印张0.5 字数10千字 2019年10月第1版 2019年10月北京第1次印刷 书号：16109·4872 定价：12.00元 版权专有侵权必究 NY/T3446—2019 举报电话：（010）59194261 NY/T 3446—2019 全国农业食品标准 农业行业标准 奶牛短脊椎畸形综合征检测PCR法 NY/T3446—2019 中国农业出版社出版 （北京市朝阳区麦子店街18号楼） （邮政编码：100125 网址：www.ccap.com.cn) 北京印刷一厂印刷 新华书店北京发行所发行各地新华书店经销 * * 开本880mm×1230mm1/16 印张0.5 字数10千字 2019年10月第1版 2019年10月北京第1次印刷 书号：16109·4872 定价：12.00元 版权专有侵权必究 NY/T3446—2019 举报电话：（010）59194261