ICS 65.020.01 B 05 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3436—2019 柑橘属品种鉴定 SSR分子标记法 Identification of Citrus varieties-SSR marker method 2019-01-17发布 2019-09-01实施 中华人民共和国农业农村部发布 NY/T 3436—2019 目 次 前言 范围· 2 规范性引用文件 术语和定义 主要仪器设备及试剂 5 溶液配制 引物相关信息及使用 参照品种及使用 8 操作程序 9 结果统计 10结果判定 附录A(规范性附录） 主要仪器设备及试剂. 附录B(规范性附录) 溶液配制· 附录C(规范性附录) 核心引物名单及序列 附录D(规范性附录) 核心引物相关信息 附录E(资料性附录) 参照品种名单… I NY/T 3436—2019 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本标准由农业农村部种业管理司提出。 本标准由全国植物新品种测试标准化技术委员会（SAC/TC277)归口。 本标准起草单位：农业农村部科技发展中心、湖南农业大学、西南大学。 本标准主要起草人：唐浩、李益、韩瑞玺、江东、邓超、马莹雪、李娜、邓子牛、赵艳杰。 NY/T3436—2019 柑橘属品种鉴定 SSR分子标记法 1范围 本标准规定了利用简单重复序列（Simplesequencerepeat，SSR）标记进行芸香科（Rutaceae)柑橘属 (CitrusL.）品种鉴定的操作程序、结果统计、结果规则。 本标准适用于柑橘属品种SSR指纹数据采集和品种鉴定 2规范性引用文件 GB/T6682分析 实验 NY/T2435 植物品 种特足性 生和稳定性测试指南 NY/T2594 植物品种鉴定 3术语和定义 S NY/T2594 界 兰的术语 和定义适用于 主要仪器设备 5溶液配制 溶液配制方法见 6引物相关信息及使 核心引物名单及序 位及时筛选拓 展引物并发布相关信息 鉴定和品 异引物用手鉴定。检测机构首 先使用核心引物，其 次根据需要使用拓展引物或（和）特异 参照品种及使用 参照品种的名称参见附录E。必要时.可在等位变异检测中同时检测相应参照品种的PCR扩增 产物。 注：多个品种在某一SSR位点上可能具有相同的等位变异。 在确认这些品种该位点等位变异大小与参照品种相同 后，这些品种也可以代替附录D中的参照品种使用。 8操作程序 8.1样品准备 每份样品取不少于3个单株的叶片或其他等效物，混合分析。 8.2DNA提取 将混合后的样品放人液氮预冷的研钵中，加入液氮后迅速研磨叶片多次至粉末状，取适量粉末装入 2mL离心管。每管加人1mL预热（65℃）的2%CTAB提取液，充分混匀，65℃恒温水浴45min～60 1 NY/T 3436—2019 min，其间每隔10min颠倒混匀。于4℃，12000r/min离心15min。取上清液至一新离心管，加人等体 积的氟仿-异戊醇（24：1,V：V），轻轻颠倒混匀，静置10min，于4℃，12000r/min离心15min。取上 清液至一新离心管，加人等体积预冷的异丙醇，颠倒混匀，一20℃下静置30min。于4℃，12000r/min 离心10min，弃上清液。70%乙醇洗涤DNA沉淀2次，风干，加人50μL超纯水，加1μLRNase(10g/ L），37℃温浴30min；再加人等体积的氮仿-异戊醇（24：1V：V），于4℃，12000r/min离心15min；取 上清液，加人等体积预冷的异丙醇，颠倒混匀，一20℃下静置30min；12000r/min常温离心15min，弃 上清液。用70%乙醇浸泡洗涤DNA沉淀2次，风干，加人100μL无菌水或TE缓冲液，通过紫外分光 光度计和琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度和质量，一20℃保存。 注：以上为推荐的DNA提取方法，所获DNA质量能够满足PCR扩增要求的其他DNA提取方法都适用于本标准。 8.3PCR扩增 8.3.1反应体系 各组分终浓度如下：每种dNTP0.20mmol/L，正向、反向引物各0.25μmol/L，TaqDNA聚合酶 体积。 利用毛细管电泳进行荧光检测时需使用荧光标记的引物。引物标记的荧光颜色见附录D。 注：反应体系的体积可根据具体情况进行调整。可采用2X Tag PCR master Mix代替 Taq DNA聚合酶、dNTP、 Mg?+。 8.3.2反应程序 94℃预变性5min；94℃变性40s，60℃退火40s，72℃延伸45s（可根据扩增片段的长度做出适当调 整），共35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。 注：预变性和变性温度可以是94℃或者95℃，根据所使用的Mix的要求调整。 8.4PCR产物检测 8.4.1变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) 8.4.1.1清洗玻璃板 将玻璃板清洗干净，用双蒸水擦洗2遍，95%乙醇擦洗2遍。在带凹槽的短板上涂1mL剥离硅烷 工作液，长板上涂1mL亲和硅烷工作液。操作过程中防止2块玻璃板交叉污染。 8.4.1.2组装电泳板 待玻璃板彻底干燥后组装，在玻璃板两侧的前中后位置用夹子固定，并用水平仪调平。 8.4.1.3灌胶 在50mL6.0%PAGE胶中分别加人350μL10%的过硫酸铵和35μLTEMED，迅速混匀后灌胶 （胶的体积根据玻璃板的面积及鲨鱼齿梳子厚度进行调整）。灌胶过程中防止出现气泡。待胶液充满玻 璃板夹层，将1mm厚的鲨鱼齿梳子平齐端向里轻轻插人胶液约0.4cm。胶液在室温下聚合2h以上。 胶聚合后，清理胶板表面溢出的胶液，轻轻拔出梳子，用水清洗干净备用。 8.4.1.4预电泳 将玻璃板与电泳槽组装，在正极槽（下槽）中加入1XTBE缓冲液800mL，在负极槽（上槽)加入1X TBE缓冲液1000mL(缓冲液具体用量视电泳槽型号而定）。5V/cm预电泳10min～20min。 8.4.1.5变性 在20μLPCR产物中加入4μL6×加样缓冲液，混匀。在PCR仪上95℃变性5min，取出，迅速置 于冰上，冷却10min以上。 8.4.1.6电泳 用移液器清除凝胶顶端气泡和杂质。将鲨鱼齿梳子梳齿端插人凝胶1mm～2mm。每一个加样孔 点人3uL～5μL样品，在胶板一侧点人DNAMarker。5V/cm条件下电泳，使凝胶温度保持在约 2 NY/T3436—2019 50℃，电泳1h～2h（电泳时间取决于扩增片段的大小范围）。 注：具体功率大小根据电泳槽的规格型号和实验室室温设定。 8.4.1.7银染 a) 固定：将附有凝胶的玻璃板浸人固定液中，使固定液没过凝胶，在摇床上轻轻晃动5min； 漂洗：取出玻璃板，用双蒸水漂洗30s； ) 染色：将玻璃板置于染色液中，使染色液没过凝胶，在摇床上轻轻晃动2min～5min； (P 漂洗：用双蒸水快速漂洗，时间不超过30S； e) 显影：将玻璃板置于在显影液中，使显色液轻轻摇晃动至出现清晰带纹； 定影：将凝胶在固定液中定影5min g） 漂洗：用双蒸水漂洗30s 将胶板放在X胶片观察灯I 上拍照记录。 PUBLI NIHSI 8.4.2毛细管电泳荧光检测 8.4.2.1PCR产物样品准备 超纯 水稀释 释后的PCR产物混匀 液中吸取 种稀 混 uL加入DNA分 析仪专用96孔板中 中各孔分 别加大 量内标和8 电酰胺 将 样品在PCR 仪上95℃变性5min， 取出即 置手冰 和10min以 灶上娇时离心10s 放到 分析仪上。 注：其他等吸收波长的 的荧光标 都可使用 光标记己的护增 物的稀择倍数通过荧光毛细 页实验确定。 ARCH 按照仪器操 行运行木 U 9结果统计 9.1# 数据表示 CEI 每个SSR位 等位交 小的形 9.2变性聚丙烯酰胺 凝胶电泳 将待测样品某 点扩增 较根 照品种的迁 E 确定待测 移位置和扩增片段大 的等位变导 9.3毛细管电泳荧光检测 使用毛细管电泳检测 备的片 分析软件读出待测品种与对应参照品种的 变异数据。比较 设 参照品种的等位变异大小数据与表D.1参照品种箱应的数据，两者之间的差 为系统误差。从待测 样品的等位变异数据中去除该系统误差，并依据表D.中参照的等位变异 亍取整，得到的数据即为 待测样品在该位点上的等位变异 9.4结果记录 纯合位点的等位变异大小数据记为X/X,其中X为该位点等位变异的大小；杂合位点的等位变异 大小数据记录为X/Y,其中X、Y分别为该位点上的2个等位变异的大小，小片段数据在前、大片段数据 在后。缺失位点的等位变异大小数据记录为0/0。 示例1:样品在某个位点上仅出现1个等位变异，大小为160bp，则该位点的等位变异数据记录为160/160。 示例2：样品在某个位点上有2个等位变异，分别为160bp、165bp，则该位点的等位变异数据记录为160/165。 10结果判定 10.1结果判定 当样品间差异位点数2，判定为“不同”；当样品间差异位点数1，判定为“近似”；当样品间差异位 3 NY/T3436—2019 点数一0，判定为“极近似或相同”。 10. 2 结果表述 待测样品 与对照样品 (或数据库中 已知品种）利用 分子标记类 型,采用 检测平台，采用 位点组合进行检测，结果显示：检测位点数为 一，差异 位点数为 ，判定为 （相同或极近似、近似、不同）。 差异位点小于2个位点时，推荐按照NY/T2435的规定进行田间鉴定。 4