ICS 07.080 B 47 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3421—2019 家蚕核型多角体病毒检测 荧光定量PCR法 Detection of Bombyx mori nucleopolyhedrovirusReal time PCR method 2019-01-17发布 2019-09-01实施 中华人民共和国农业农村部发布 NY/T 3421—2019 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由农业农村部种植业管理司提出。 本标准由全国桑蚕业标准化技术委员会（SAC/TC437)归口。 本标准起草单位：江苏科技大学、西南大学、中国农业科学院蚕业研究所、苏州大学、华南农业大学、 农业农村部蚕桑产业产品质量监督检验测试中心（镇江）。 本标准主要起草人：吴萍、潘敏慧、郭锡杰、贡成良、孙京臣、董战旗、陈涛、侯启瑞、商琪。 NY/T3421—2019 家蚕核型多角体病毒检测 荧光定量PCR法 1范围 本标准规定了家蚕核型多角体病毒（Bombyamorinucleopolyhedrovirus，BmNPV）的实时荧光定 量PCR检测方法。 本标准适用于家蚕核型多角体病毒的检测 2规范性引用文件 改单)适角于本 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修 N GB/T6682 分析实 3术语和定义 A 下列术语和 定义 文件 S 3. 1 gp64基因 p64 gehe 杆状病毒囊膜蛋白基肉 编码出芽型病毒 R 4缩略语 U 下列缩略语适 用手本 艾件 BmNPV: 核型多 Ct值：每个 立管内白 dNTPs:脱氧 bor 种脱氧核糖核 苷酸dATP、dT TP PBS:磷酸缓冲盐 PCR：聚合酶链 mie SDS：十二烷基磺酸 (sodiur sulfate 5原理 利用荧光信号伴随目的PCR 物的增加而增强的原理，收集PC 增过程的荧光信号值，根据Ct 值判断供试样品是否含有家蚕核型多角体病毒。根据BmNPr 基因的保守序列设计特异性PCR 引物进行PCR扩增反应。 6试剂与材料 6.120%SDS：称取20gSDS溶解于200mL烧杯中，加入80mL水，60℃水浴加热并用玻璃棒充分搅 拌至溶解，定容至100mL。高压灭菌后，置于4℃冰箱保存备用。 6.26mol/LNaCl:称取351gNaCI放人容量为1L的烧杯中，加入800mL水，玻璃棒充分搅拌至溶 解，定容至1L。高压灭菌后，置于4℃冰箱保存备用。 6.3蛋白酶K20mg/mL：称取200mg蛋白酶K加入到9.5mL水中，轻轻摇动，至蛋白酶K完全溶 解，加水定容至10mL，分装成小份置于一20℃冰箱保存备用， 1 NY/T3421—2019 6.470%乙醇。 6.5异丙醇。 6. 6 PBS(组分: NaCI 136. 89 mmol/ L; KCI 2. 67 mmol/ L; Na2 HPO 8. 1 mmol/ L; KHzPO4 1. 76 mmol/L;pH=7. 2~7. 4)。 6.7苯基硫脲。 6.8 RNase酶。 6.9荧光定量PCR试剂盒。 6.10灭菌的枪头和离心管。 注：除另有规定外，所用生化试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682一级水的规定。 7主要仪器设备 7.1实时荧光定量PCR仪。 7.2紫外分光光度计。 7.3高速冷冻离心机。 7.4一20℃冰箱和-80℃冰箱。 7.5组织研磨器或研钵。 7.6微量加样器。 8样品 8.1样品采集 8.1.1血液：用灭菌针刺破家蚕幼虫腹足或尾足，在冰上将血液采集于加了少量苯基硫脲的试管中， 12000g，4℃离心30min，吸取上清液，一20℃冰箱保存备用。 8.1.2组织：采集家蚕组织（50mg~100mg)后迅速放入液氮中，再转移至一80℃冰箱保存备用。 8.2样品DNA提取 8.2.1将组织样品放入预冷的研钵中加入液氮，用研杆将待检样品磨成粉末状，研磨过程中保持液氮 不挥发干净。亦可用组织匀浆器按操作说明书处理样品。 8.2.2在血液或按步骤8.2.1制备的样品中加人400μL灭菌的PBS、4μL10mg/mLRNase酶、 40μL20%SDS和8μL20mg/mL蛋白酶K，混合均匀，并将样品置于55℃~60℃水浴10min~15 min，或者放置室温直至溶液澄清。 8.2.3在8.2.2溶液中加人300μL6mol/LNaCl溶液，反复颠倒，轻柔混匀。12000g，4℃离心10 min，收集上清液。 8.2.4将上清液转移至新的已灭菌的离心管中，加入等体积的异丙醇或者2倍体积的无水乙醇，混合 均匀后放置一20℃冰箱30min，12000g，4℃离心10min，弃上清液，保留DNA沉淀。 8.2.5加人500μL70%预冷乙醇洗涤沉淀，12000g，4℃离心5min，去乙醇。 8.2.6将DNA沉淀置于室温下自然风干5min～10min，用30μL～40μL的无菌超纯水常温溶解 DNA。 8.2.7利用紫外分光光度计测定DNA溶液的光密度值。当A260/A280值为1.75～1.85时，提取的 DNA质量符合PCR的检测要求。调整DNA浓度至50ng/μL并置于一20℃冰箱保存备用。 注：以上提供的DNA提取方法并非唯一方法。其他提取方法或市售商品化DNA提取试剂盒也可使用。 8.3实时荧光定量PCR检测 8.3.1引物序列 2 NY/T3421—2019 正向引物：5-CACCATCGTGGAGACGGACTA-3； 反向引物：5-CCTCGCACTGCTGCCTGA-3。 荧光定量PCR产物信息见附录A。 8.3.2对照设置 阳性对照：含有经8.3.1引物扩增的gp64基因片段的重组质粒DNA，拷贝数为1.0X104个/μL。 阳性质粒制备方法见附录B。 阴性对照：健康家蚕基因组DNA，浓度为50ng/μL。 空白对照：灭菌超纯水。 8.3.3PCR反应体系 反应体系20μL：2×SYBRPremixExTaqTM10μL，10μmol/L正、反向引物各0.4μL,DNA模板 1μL，超纯水8.2μL。反应程序：95℃预变性2min，95℃5s，60℃31s，共40个循环。每个样品重复3 次。可按照其他市售商品化试剂盒说明书进行荧光定量PCR反应。 8.3.4PCR反应质量控制 扩增反应结束后，阳性对照出现典型的扩增曲线，空白对照和阴性对照的荧光曲线平直或低于阳性 对照荧光值的15%，表明反应体系工作正常。否则，表明PCR反应体系不正常需重新检测。 9结果判定 在PCR反应体系正常工作的前提下，根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果。判定规则如下： a) 待测样品检测Ct值小于或等于阳性对照的Ct值，判定该样品检出家蚕核型多角体病毒； b）待测样品检测Ct值大于或等于阴性对照的Ct值，判定该样品未检出家蚕核型多角体病毒； 复实验结果出现典型的扩增曲线，Ct值仍然在此范围，判定该样品疑似含有家蚕核型多角体 病毒。 3 NY/T3421—2019 附录A （规范性附录） 荧光定量PCR产物相关信息 A. 1 检测基因 BmNPVgp64基因，GeneID:1488736 A.2扩增产物大小及序列 扩增产物179 bp CACCATCGT CT GAAAACGI TC ACAA AGGGGTACTACCAG GCGTATGCGTA AGG FCGCTGGATCCCAACA ACG GAAT TCCATGAAAACGC TGACTGT AGATT 注：划线 部 NY/T3421—2019 附录B (规范性附录） 阳性质粒的制备 B.1以BmNPV的基因组DNA为模板，用gp64正向引物和反向引物扩增目的基因片段,PCR反应 体系25μL：10×PCR缓冲液2.5μL，dNTPs（各10mmol/L)0.5μL，正、反向引物（10μmol/L)各0.6 μL,DNA模板（50ng)1.0μL,Taq酶（5U/μL)0.5μL,灭菌水19.3μL。反应条件为：94℃2min;94℃ 30s,55℃40s，72℃40s，35个循环；72℃延伸10min。反应结束后，取5uLPCR产物在2%的琼脂糖 凝胶上进行电泳分析。 B.2PCR产物经电泳鉴定后，按试剂盒说明书进行胶回收纯化目的片段，将目的片段与克隆载体连 接，将其转化感受态细胞，提取重组质粒并进行测序验证。 B.3阳性质粒用碱裂解法进行提纯，根据紫外分光光度计测定OD26o的值计算质粒浓度，质粒拷贝数 按式(B.1)计算。 = (B.1) w 式中： 质粒拷贝数的数值，单位为每毫升质粒拷贝数（个/mL）； 阿伏伽德罗常数，通常表示为6.02×1023，单位为每摩尔物质所含的基本单元（分子或原 子）的数量（个/mol）； 质粒浓度的数值，单位为克每毫升（g/mL）； 质粒平均分子量的数值，单位为克每摩尔（g/mol)。 B.4将阳性质粒拷贝数稀释至1.0×104个/μL，置于一20℃冰箱保存备用。 5