ICS 65.020.01 B 04 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3346—2019 马铃薯抗青枯病鉴定技术规程 Technical code of practice for evaluation of potato resistance to bacterial wilt 2019-01-17 发布 2019-09-01实施 中华人民共和国农业农村部发布 NY/T 3346—2019 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由农业农村部种植业管理司提出并归口。 本标准起草单位：中国农业科学院蔬菜花卉研究所。 本标准主要起草人：杨宇红、谢丙炎、振川、凌键、李彦。 I NY/T3346—2019 马铃薯抗青枯病鉴定技术规程 1范围 本标准规定了马铃薯抗青枯病（bacterialwilt)鉴定方法与评价标准。 本标准适用于马铃薯（SolanumtuberosumL.）品种和材料对青枯病抗性的室内鉴定及评价。 2规范性引用文件 文件 NY/T1858.4 SN/T1135.9 马铃薯青枯病菌检型鉴定方法 3术语和定义 NY/T1858 定的以 下列术语和定义适用 S 3. 1 马铃薯青枯病 Potalo bacterialwilt 由茄科劳尔氏 菊[Rls 220 macear 侵染 味引起的一种全 株性萎的细菌性 宜生物学 L附录A 3. 2 U 生理小种 病原物种内在 形态土 和品 4试剂与材料 c 除非另有说明 4.1 TTC(2,3,5 称取1gTTC溶 ML 4℃的棕色试剂 瓶中备用。 4.2培养基 培养基包括青枯菌培养基和 铃薯组土 养基的配 配制方法见附录B。 4.3对照材料 以马铃薯‘米拉或‘合作-88°等感病品种为感病对照 4.4育苗基质 直接购买商品化蔬菜育苗基质。亦可将草炭、蛭石和菜田土按体积2：1：1的比例混合均匀，于 (134士1)℃湿热灭菌1h。 4.5其他用品 培养皿、离心管、枪头、冻存管、手术刀、剪刀、移植环、烧杯、量筒、试剂瓶、锥形瓶、酒精灯、组培苗培 养盒、育苗钵等。 5 仪器设备和设施 恒温光照培养箱、高压灭菌锅、移液器、电子天平、超净工作台、冰箱、人工接种鉴定室等。 1 NY/T 3346—2019 6材料育苗 育苗包括试管苗培养和盆栽育苗，见附录C。 7接种体制备 7.1青枯病菌分离、纯化 按照SN/T1135.9的规定进行青枯病菌的分离、纯化、鉴定和保存。 7.2接种体繁殖、制备 选择马铃薯青枯菌的优势小种生理小种3号作为接种病原菌，小种鉴定方法参见附录D。用接种 环蘸取菌液在TTC培养基平板上划线，在28℃恒温培养箱中培养48h后，挑取边缘乳白色、中间部位 淡红色、流动性好的毒性单菌落，移入青枯菌液体培养基中，28℃200r/min振荡培养16h～18h，加适 量无菌水配成接种的病菌悬浮液。 8鉴定方法 8.1试管苗接种鉴定 8.1.1接种时期 在组培苗培养基中培养3周的试管苗。 8.1.2接种浓度 约 1X108CFU/mL(OD600=0. 1)。 8.1.3接种方法 采用伤根接种法。选用生长一致的马铃薯试管苗3盒，试管苗繁殖见C.1.3，使用手术刀片于无菌 环境下围绕植株根部在培养基划“#”伤根，随后每盒试管苗注人接种菌液5mL。每份材料设3个重 复，每重复不少于10株苗。 8.1.4接种后管理 接种后置于（28士1)℃的光照培养箱内，在每日光照16h、黑暗8h条件下培养。 8.1.5病情调查 8.1.5.1调查方法 从接种后第6d开始，每隔2d观察鉴定材料的发病情况，待感病对照达到相应病级后，调查每份鉴 定材料接种株发病情况，根据表1中的病害症状描述，逐份材料逐株进行调查，记载接种株病情级别，按 式（1)计算病情指数（diseaseindex，DI）。 Z(sXn) DI = X 100 :(1) NXS 式中: DI 病情指数； s 各病情级别数值； n 各病情级别的病株数，单位为株； N 调查的总株数，单位为株； S 病情级别的最高数值。 8.1.5.2病情级别划分 试管苗植株病情分级及其对应的症状描述见表1。 2 NY/T3346—2019 表1马铃薯抗青枯病接种鉴定的病情级别划分 病情级别 症状描述 0 无发病症状 1 1%～25%的叶片萎 2 26%~～50%的叶片萎蕉 3 51%～75%的叶片萎蕉 4 75%以上叶片萎為或植株死亡 8.2温室盆栽鉴定 8.2.1接种时期 待幼苗长到6片8片复叶时，选择生长 致、健壮的幼苗用于抗病性鉴定。 8.2.2接种浓度 UB 同8.1.2。 8.2.3接种方法 采用菌液灌根接种法 接种前 2cm处，下切 部切份，沿切口倒 10mL青枯菌接种液 鉴定材 料随机或 5cm左右深度将幼苗根音 顺序 排列，每份鉴定 材料设3个重复 重复不 10株 ESE S 8.2.4接种后管理 显度 接种后浇水使 壤湿度 保持在 相 左右的日光 ARCH RA 温室中，自然光 8.2.5病情调 U 8.2.5.1调查方 法可8. 调查及计算 8.2.5.2病情 级别 划分 接种植株病情 别划 8.2.6鉴定材料 鉴定完毕后， 售发 签定的育 用高温灭菌。 ER U 9 抗病性评价 9.1试管苗接种鉴定抗病性评价 9.1.1评价标准 抗性划分标准见表2。 表2马铃薯抗青枯病试管苗接种鉴定的评价标准 病情指数(DI) 抗性评价 D<20 高抗(HR) 20<D≤40 抗病(R) 40<DI≤60 中抗(MR) 60<DI≤80 感病(S) DI>80 高感(HS) 9.1.2 鉴定有效性判别 当感病对照材料达到其相应感病程度（DI>60），该批次抗青枯病鉴定结果视为有效。 9.1.3抗性判断 3 NY/T 3346—2019 依据鉴定材料3个重复的平均病情指数(DI)确定其抗性水平，写出正式鉴定报告，并附原始记录。 鉴定结果记录见附录E。 9.2温室盆栽鉴定抗病性评价 9.2.1评价标准 抗性划分标准见表3。 表3马铃薯抗青枯病温室盆栽鉴定的评价标准 病害指数(DI) 抗性评价 DI≤10 高抗(HR) 10<DI<25 抗病(R) 25<DI≤50 中抗(MR) 50<DI≤75 感病(S) DI>75 高感(HS) 9.2.2 鉴定有效性判别 当感病对照的植株达到其相应感病程度(DI>50），该批次鉴定结果视为有效。 9.2.3 3抗性判断 判断方法同9.1.3。 4 NY/T 3346—2019 附录A （资料性附录） 马铃薯青枯病 A.1症状描述 幼苗和成株期均能发生，多从现蕾开花后急性显症，表现为叶片、分枝和植株急性萎，开始时早晚 尚可恢复，4d～5d全株茎叶萎枯死，但病株短期内仍保持绿色，叶片不脱落，随后叶脉逐渐变褐，茎 部出现褐色条纹，横切病株茎部可见维管束变褐，用手挤压可见乳白色菌脓从切口处溢出。如将病茎切 面插入清水中，约0.5min后可见雾状的菌液自切口处排出。块茎染病后，脐部呈灰褐色水渍状，切开 病薯，维管束环变褐，稍挤压便溢出乳白色细菌脓液，严重时块茎外皮龟裂，髓部软腐溃烂。 A.2 病原菌 A.2.1学名 茄科劳尔氏菌[Ralstoniasolanacearum（Smith)Yabuuchietal.」，属于薄壁菌门劳尔氏菌属。 A.2.2形态描述 菌体单细胞，短杆状，两端钝圆，大小为（0.9～2.0）um×（0.5～0.8）μm，单生或双生，极生鞭毛 1根～3根，无芽孢和荚膜。在肉汁葡萄糖琼脂培养基上，菌落呈圆形或不规则形，稍隆起，平滑有光泽。 A.2.3生物学特性 革兰氏染色阴性，病菌在10℃～40℃均可发育，生长发育最适温度为30℃～37℃，致死温度为 52℃；酸碱度的适宜范围为pH6～8,最适土壤pH为6.6，具有明显的生理分化和菌系多样性，长期人 工培养后易失去致病力。 5