ICS 67.060 X 11 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T3342—2018 花生中白藜芦醇及白藜芦醇苷异构体 含量的测定 超高效液相色谱法 Determination of resveratrol and resveratrol glycoside isomers in peanut- Ultra performance liquid chromatography method 2018-12-19发布 2019-06-01实施 中华人民共和国农业农村部发布 NY/T3342—2018 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由农业农村部乡村产业发展司提出并归口。 本标准起草单位：中国农业科学院农产品加工研究所、山东金胜粮油集团、山东东升粮油有限公司。 本标准主要起草人：王强、石爱民、夏小勇、刘红芝、刘丽、胡晖、高冠勇、胡玉中。 NY/T3342—2018 花生中白藜芦醇及白藜芦醇苷异构体 含量的测定 超高效液相色谱法 1范围 本标准规定了测定花生中白藜芦醇及白藜 醇甘异构体（反式白藜芦醇、反式白藜芦醇苷、顺式白 藜芦醇、顺式白藜芦醇苷)含量的超高效液相色普法JBL 本标准适用于花生仁 本标准方法反式白 页式白藜芦醇、顺式白藜芦 醇苷定量检出限为3 规范性引用文件 下列文件对 文化的应 用是必不少 版本适用于本文 件。凡是不注日 引用文 其最新版 期 包活所 GB 5491 验托样分样 GB/T6682 室用水规格和试 3术语和定义 下列术语和定 CE 3. 1 白藜芦醇及 屏异构体 resveratrol and resver atrolglycoside 反式白藜芦配 芝醇 E ceid顺式 resveratrol) 顺式白藜芦醇苷（c A ER 4原理 试样中的白藜芦醇及 蒙芦醇音异构体用乙醇 水溶液提取，提取液离心 上清液定容，用配有 紫外检测器或二极管阵列检测器的超高效液相色谱仪进行测定以保留时间 定性，外标法定量。 5试剂和材料 除非另有规定，仅使用分析纯试剂，实验中所用水应符合CB/T6682中一级水的要求。 5.1 无水乙醇(CH,OH)。 5.2甲醇(CHOH)：色谱纯。 5.3甲酸（HCOOH)：色谱纯。 5.480%乙醇溶液：取800mL无水乙醇（5.1)，加200mL水，混匀。 5.5液相流动相： A相：0.1%甲酸水溶液，取1mL甲酸（5.3），加999mL水，混匀并脱气。 B相：甲醇，取1L甲醇（5.2)，脱气。 5.6 6反式白藜芦醇CAS号：501-36-0）：纯度≥98%。 5.7 反式白藜芦醇苷（CAS号：65914-17-2)：纯度≥98%。 NY/T3342—2018 5.8标准储备溶液：分别准确称取反式白藜芦醇、反式白藜芦醇苷标准品6.25mg（精确至0.01mg）， 分别用甲醇（5.2)溶解并定容至250mL，得到25mg/L的单标储备液。顺式白藜芦醇和顺式白藜芦醇 苷储备液是由反式白藜芦醇及反式白藜芦醇苷标准溶液置于365nm紫外光下分别照射120min和60 min制得。 5.9混合标准工作液：准确移取0.1mL、1.0mL、5.0mL、10.0mL、15.0mL、20.0mL反式白藜芦醇、 反式白藜芦醇苷标准储备溶液（5.8），用甲醇（5.2)稀释并定容至50mL，得到一系列的标准工作溶液 （质量浓度分别为0.05mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、5.0mg/L、7.5mg/L、10.0mg/L）。取适量反式白 藜芦醇及反式白藜芦醇苷标准储备溶液（5.8），置于干燥洁净的培养皿中，于365nm紫外光下10cm处 分别照射2h和1h，反式白藜芦醇溶液分别于20min、40min、60min、80min、100min、120min时间点 取样，反式白藜芦醇苷溶液分别于10min、20min、30min、40min、50min、60min时间点取样，装人棕色 液相色谱进样瓶；随后准确量取0.5mL照射120min的反式白藜芦醇标准溶液及0.5mL照射60min 的反式白藜芦醇苷标准溶液，按1：1比例混合均匀，制得混合标准工作液，装人棕色液相色谱进样瓶 中，于一18℃下避光保存，保存有效期为1个月。 6仪器和设备 6.1超高效液相色谱仪：带紫外检测器或二极管阵列检测器。 6.2紫外分析仪：波长365nm。 6.4粉碎机：高速万能粉碎机，转速24000r/min，或相当的设备。 6.5匀浆机：不低于5000r/min，或相当的设备。 6.6离心机：不低于5000r/min，或相当的设备。 6.7涡旋振荡器：0r/min~3300r/min。 6.8天平：感量0.01mg、0.01g。 6.9滤膜：孔径0.22μm、直径25mm的聚矾膜或相当者。 7操作步骤 7.1试样制备与保存 花生果样品脱壳，花生仁、花生红衣样品直接取样，花生芽需预先冻干处理。 分取花生仁约100g，用粉碎机（6.4)粉碎2min～3min；取花生红衣、冻干处理后的花生芽约100 g，用粉碎机（6.4）粉碎2min～3min，过250μm筛。如需保存，应于一18℃保存。 7.2提取 准备称取5g（精确至0.01g）样品于100mL离心管中，加人60mL80%乙醇溶液（5.4)，在匀浆机 中匀浆提取2min后，于5000r/min离心10min，将上清液转人100mL棕色容量瓶中，样品残渣再分 别用10mL80%乙醇溶液（5.4)提取2次，合并3次提取液，用80%乙醇溶液（5.4)定容至100mL，摇匀 后过0.22μm滤膜，置入棕色液相色谱进样瓶中，待测， 7.3测定 7.3.1超高效液相色谱参考条件 色谱参考条件如下： a) 色谱柱：C8，2.1mm×100mm，1.8μm，或性能相当者； b) 流动相：A相为0.1%甲酸水溶液（5.5)，B相为甲醇（5.5)，梯度洗脱条件见表1； c) 流速：0.45mL/min； 2 NY/T3342—2018 d）检测波长：285nm、306nm； e) 柱温：35℃； 进样量：1μL。 表1# 梯度洗脱条件 流动相，% 时间，min A相 B相 0 90 10 0. 5 90 10 2. 0 75 25 3. 5 70 30 4. 0 65 35 5. 0 50 50 7. 0 10 06 7. 2 06 10 10. 0 06 10 7.3.2标准曲线 反式白藜芦醇和反式白藜芦醇苷的标准曲线绘制：取反式白藜芦醇和反式白藜芦醇苷标准储备液 （5.8），参考上述色谱条件（7.3.1)进行测定，以标准溶液的浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制反式白 藜芦醇和反式白藜芦醇苷的标准曲线。 顺式白藜芦醇和顺式白藜芦醇苷的标准曲线绘制：取适量反式白藜芦醇及反式白藜芦醇苷标准储 备溶液，置于干燥洁净的培养皿中，于365nm紫外光下10cm处分别照射120min和60min，反式白藜 芦醇溶液分别于20min、40min、60min、80min、100min、120min时间点取样，反式白藜芦醇苷溶液分 别于10min、20min、30min、40min、50min、60min时间点取样，进行超高效液相色谱分析，测定反式白 藜芦醇及反式白藜芦醇苷峰面积，由反式白藜芦醇和反式白藜芦醇苷的标准曲线求出反式体的浓度，再 由反式体浓度的减少求出溶液中顺式体的浓度，以顺式白藜芦醇及顺式白藜芦醇苷浓度为横坐标、峰面 积为纵坐标，以此建立顺式白藜芦醇和顺式白藜芦醇苷的标准曲线。 7.3.3色谱分析 分别将混合标准工作液和试样溶液进样，以保留时间定性，以样品溶液白藜芦醇各异构体峰面积与 标准溶液峰面积比较定量。标准样品色谱图参见附录B。 8结果计算 样品中白藜芦醇及白藜芦醇苷异构体的含量按式(1)计算。 (1) A,Xm 式中： X, - 样品中白藜芦醇或白藜芦醇苷异构体的质量分数，i=1,2,3,4,X1为反式白藜芦醇、X2为 反式白藜芦醇苷、X3为顺式白藜芦醇、X为顺式白藜芦醇苷，单位为毫克每千克（mg/ kg); 标准溶液中白藜芦醇或白藜芦醇苷异构体的浓度，单位为毫克每升（mg/L)； A 样液中白藜芦醇或白藜芦醇苷异构体的峰面积数值； V 试样最终定容体积，单位为毫升（mL）； A. 标准溶液中白藜芦醇或白藜芦醇苷异构体的峰面积数值； 3 NY/T3342—2018 样品质量，单位为克（g）。 测定结果取3次测定的算术平均值，计算结果保留至小数点后3位。 在重复性条件下获得的2次独立测定结果的绝对数值不得超过算术平均值的10%。 NY/T3342—2018 附录A (资料性附录） 白藜芦醇及白藜芦醇苷异构体分子式与结构式 白藜芦醇及白藜芦醇苷异构体分子式与结构式见图A.1。 _OH HQ HO HO HO 反式白藜芦醇(CuHi20,) 顺式白藜芦醇(CuHi20,) OH. HO QH HO HO MOH YOH HO HO- 反式白藜芦醇苷（CaHaOs) 顺式白藜芦醇苷(CiH20.) 图A.1 白藜芦醇及白藜芦醇苷异构体分子式与结构式 5