ICS 65.120 B 46 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3322—2018 饲料中柠檬黄等7种水溶性色素的测定 高效液相色谱法 Determination of tartrazine 7 kinds of water-soluble pigment in feeds- High performance liquid chromatography 2018-12-19发布 2019-06-01实施 中华人民共和国农业农村部发布 NY/T3322—2018 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由农业农村部畜牧兽医局提出。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76)归口。 本标准起草单位：河南省兽药饲料监察所。 本标准主要起草人：吴宁鹏、孟蕾、宋志超、陈小鸽、宋善道、舒畅、刘素梅、巩丹、邱天宝、周小娟、于 辉、陈少渠。 I NY/T3322—2018 饲料中柠檬黄等7种水溶性色素的测定 高效液相色谱法 1范围 本标准规定了饲料中柠檬黄、苋菜红、胭脂红、靛蓝、亮蓝、日落黄、诱惑红7种水溶性色素含量的液 相色谱测定方法。 本标准适用于食品动物配合饲料和浓缩饲料、宠物饲料、观赏鱼饲料中柠檬黄、苋菜红、胭脂红、靛 本标准亮蓝的检出限为 、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑 红的检出限为0.5mg/kg，定量 1. ，定量限为2.0mg/kg。 ND 2规范性引用文件 万 下列文件对于 必不可少的凡 昆注 期的用文件 不适用于本文 件。凡是不注日期的弓 用文件 其最新版不包括所有的修改单适用于本 GB/T6682 析实验 用水规格和试验方法 GB/T14699 饲料 采样 GB/T20195 动物饲 UR 3原理 二醇水浮 用碱性乙睛丙 固相萃取柱净 化，高效液相色谱测 定外标 CE 4试剂或材料 除非另有说明 本 分析纯：水为GB/T6682规定的 水 4.1柠檬黄、苋菜红 于95.0%。 4.2甲醇：色谱纯。 4.3乙腈：色谱纯。 4.4甲酸：含量不低于88% 4.5乙酸铵溶液(0.02mol/L,pH为5.0)：称取乙酸铵0.778g，用水溶解并稀释至500mL,混匀，用乙 酸调节pH至5.0。 4.6提取液：取乙腈250mL、丙二醇50mL、水190ml氨水10mL，混勺。 4.72%甲酸溶液：取甲酸2mL，用水稀释至100mL。 4.81%甲酸溶液：取甲酸1mL，用水稀释至100mL。 4.9甲酸甲醇溶液：取甲醇80mL，用1%甲酸溶液（4.8)稀释至100mL。 4.1010%氨化甲醇溶液：取氨水10mL，用甲醇稀释至100mL。 4.11标准储备液（1mg/mL）：分别精密称取柠檬黄、苋菜红、胭脂红、靛蓝、亮蓝、日落黄、诱惑红（4.1) 对照品约10mg（准确至0.01mg），置10mL棕色容量瓶中，用水稀释并定容，分别配制成1mg/mL的 标准储备液。0℃～4℃避光保存，有效期为6个月；靛蓝标准储备液于0℃～4℃避光保存，有效期为1 个月。 4.12混合标准中间液(100μg/mL)：分别准确移取标准储备液（4.11)各1mL，置10mL容量瓶中，用 1 NY/T3322—2018 水稀释至刻度，混匀。配制成100uμg/mL的混合标准中间液。0℃～4℃下避光保存，有效期为1周。 4.13弱阴离子交换固相萃取柱（WAX)：含亲水基团的聚苯乙烯/二乙烯基苯共聚物上键合哌嗪基团， 500mg/6mL，或性能相当的萃取柱。 4.14微孔滤膜（0.45μm）：尼龙滤膜或性能相当者。 5仪器设备 5.1高效液相色谱仪：配二极管阵列检测器或者可变多波长紫外可见检测器， 5.2分析天平：感量0.01mg。 5.3天平：感量0.001g。 5.4离心机：转速不低于10000r/min。 5.5振荡器。 5.6涡旋振荡器。 5.7超声波清洗器。 5.8 固相萃取装置。 5.9氮吹仪。 5.10酸度计。 6样品 按GB/T14699.1抽取有代表性的饲料样品，用四分法缩减取样。按照GB/T20195制备样品，粉 碎后过0.45mm孔径的分析筛，混匀，装入磨口瓶中，备用。 7试验步骤 7.1提取 称取试样约2g（精确至0.001g）于50mL离心管中，准确加人提取液（4.6)20mL，涡旋混合后，振 荡10min，水浴超声提取10min。10000r/min离心10min，移取上清液至另一离心管中。残渣准确加 人提取液20mL重复提取，合并上清液。准确移取上清液10mL于另一离心管中，加人水20mL，用甲 酸调至pH（2.0士0.2），混匀后，10000r/min离心10min，取上清液，备用。 7.2净化 （7.1)全部过柱。依次用2%甲酸溶液、甲酸甲醇溶液（4.9）和甲醇各5mL淋洗，抽干。再用10%氨化 甲醇溶液（4.10)5mL洗脱，将洗脱液置40℃下氮气吹干。准确加入水0.5mL溶解残余物，涡旋混匀， 过0.45μm微孔滤膜，供HPLC测定。 7.3标准曲线的制备 准确移取柠檬黄、苋菜红、胭脂红、靛蓝、亮蓝、日落黄、诱惑红混合标准中间液（4.12)适量，用水稀 释，制得浓度为0.25ug/mL、0.5ug/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL和50.0 ug/mL的标准系列溶液，由低浓度到高浓度进高效液相色谱仪测定。以色谱峰面积为纵坐标、浓度为 横坐标，绘制标准曲线。柠檬黄、苋菜红、胭脂红、靛蓝、亮蓝、日落黄、诱惑红7种水溶性色素色谱图参 见附录A。 7.4测定 7.4.1液相色谱参考条件 色谱柱：Ci8柱，柱长250mm，柱内径4.6mm，粒度5.0μm，或相当的分析柱， 2 NY/T3322—2018 流动相：A相为0.02mol/L乙酸铵溶液（4.5)；B相为乙腈，梯度洗脱，条件见表1。 检测波长：425nm、500nm和630nm，波长变化程序见表2。 流速：1.0mL/min。 进样量：10μL。 柱温：30℃。 表1 梯度洗脱条件 时间，min A相,% B相,% 0. 0 98 2 4.0 88 12 7. 5 70 30 11. 0 0 100 12.0 0 100 15.0 98 2 18.0 98 2 表2 波长变化程序 时间，min 通道一波长，nm 通道二波长，nm 0. 0 425a 630b 7. 3 425 630 7. 31 500s 630 18. 0 500 630 柠檬黄的检测波长为425nm； 靛蓝、亮蓝的检测波长为630nm； 菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红的检测波长为500nm。 7.4.2定量测定 取试样溶液和标准工作液上机分析，根据保留时间确定待测物，得到色谱峰面积响应值，通过单 标准溶液作单点校准或通过标准曲线作多点校准，用外标法定量。试样溶液中待测物的响应值均应在 仪器测定的线性范围内。若试样溶液浓度超过线性范围时，用水稀释后重新测定。 8试验数据处理 试样中待测物含量以质量分数X；表示，单位为毫克每千克（mg/kg），按式(1)和式（2)计算。 CXVXV,XnX1000 X = .(1) mXVX1000 式中： C 试样溶液中讠色素浓度，单点校准时由式（2)计算得到，多点校准时从标准曲线查得，单位 为微克每毫升（μg/mL）； V 溶解残余物的体积，单位为毫升（mL）； 过固相萃取柱的提取液体积，单位为毫升（mL）； V2 提取液总体积，单位为毫升（mL）； n 稀释倍数； m 试样的质量，单位为克（g）。 C,A C, = (2) Ai 式中： 3 NY/T 3322—2018 Cs——混合标准工作液中i色素浓度，单位为微克每毫升（μg/mL)； 试样溶液中i色素的峰面积； A 一混合标准工作液中i色素的峰面积。 测定结果用平行测定的算术平均值表示，结果保留3位有效数字。 9精密度 在重复性条件下，获得的2次独立测定结 对差值不大于这2个测定值的算术平均值的20%， 以大于20%的情况不超过5%为前提 NY/T3322—2018 附录A （资料性附录） 7种水溶性色素混合标准工作液色谱图 柠檬黄、苋菜红、胭脂红、靛蓝、亮蓝、日落黄、诱惑红7种水溶性色素混合标准工作液的色谱图见图 A.1。 0.20 [ 0.15 柠檬黄 苋菜红 0.10 0.05 0.00 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 t,min 0.30 E 亮蓝 0.25 0.20 0.10 靛蓝 0.05 0.00 A 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 t,min 图A.1 7种水溶性色素混合标准工作液（20μg/mL）的色谱图 5