ICS 65.120 B 46 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 33212018 饲料中L一肉碱的测定 Determination of L-Carnitinein feeds 2018-12-19发布 2019-06-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 NY/T3321—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由农业农村部畜牧兽医局提出。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76)归口。 本标准起草单位：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所[国家饲料质量监督检验中心 (北京）]。 本标准主要起草人：索德成、张苏、田静、魏书林、王瑞国、赵根龙、王石、樊霞。 I NY/T3321—2018 饲料中L-肉碱的测定 1范围 本标准规定了配合饲料、添加剂预混合饲料、浓缩饲料中L-肉碱的方法。 本标准中第一法离子色谱法适用于添加剂预混合饲料、浓缩饲料中L-肉碱的测定；第二法液相色 谱-串联质谱法适用于配合饲料，浓缩饲料中工-肉碱的测定 2规范性引用文件 ARD 可心 是注日期的用文 日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引 用文体其 新 （包括所有的修改单） GB/T6682 析实验室 用水规格 GB/T1468 饲料 采样 GB/T20195 动物饲 试样的制备 3第一法 离子 色谱法( R 3.1原理 试样中的L 过膜后，去适量体积或适度稀释， 谱分 离测定，外 工 标法定量。 3.2试剂或材料 除非另有规定 分析中仅使用确认为分析纯的试剂和符合GB 3.2.1甲磺酸 3.2.2盐酸溶液 HC mL盐酸于1000m 容量瓶！ 至刻度。 3.2.3L-肉碱盐酸 标准品 M 纯度 3.2.4L-肉碱盐酸盐标准储备 准确称取 0. 1gc精确至0.0001g） 1050 恒重的L-肉碱盐酸 盐标准品于100mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容 照该标准溶液的浓度为 1 mg/ /mL。2℃~8℃冷藏保 存，有效期12个月。 3.2.5L-肉碱盐酸盐标准工作液：精密量取适量L-肉碱盐酸盐标准储备液（3.2.4)置于棕色容量瓶 中，用水稀释成浓度为2μg/mL、5μg/mL、 10μg/mL、20μg/mL,50μg/mL、100μg/mL的L-肉碱盐 酸盐对照品工作液。2℃～8℃冷藏保存，有效期3个月 3.2.6流动相（1.5mmol/L甲磺酸水溶液：乙=90：10）：称取2.88g甲磺酸（精确至0.01g），用 水定容至1000mL，该溶液浓度为30mmol/L。取50mL该溶液，加入100mL乙睛，用水定容至 1 000 mL。 3.3仪器设备 3.3.1离子色谱仪，带有电导检测器。 3.3.2天平：感量0.0001g和0.01g各一台。 3.3.3离心机：转速大于5000r/min。 3.3.4超声波提取器。 3.3.5滤膜：0.45um，水系。 1 NY/T3321—2018 3.4样品 按GB/T14699.1的规定采集样品， 选取有代表性饲料样品至少500g，按GB/T20195的规定制备样品。 3.5试验步骤 3.5.1提取 称取预混合饲料试样2g（精确至0.01g），置于100mL容量瓶中，加人80mL水，混合后置于振荡 器上剧烈振荡或超声提取30min，静置10min，定容，离心或过滤，用水稀释使其浓度在2μg/mL～100 μg/mL，过0.45μm滤膜，上机测定。 3.5.2测定 3.5.2.1色谱条件 色谱柱：非抑制型阳离子交换分离柱（长250mm，内径4mm)或性能相当的其他分析柱。 流速：1.0mL/min。 柱温：40℃。 进样量：25μL。 检测器：电导检测器。 3.5.2.2测定 待IC分析仪基线平稳后，连续注入L-肉碱标准溶液，直至得到峰面积能够重现的色谱峰。 依次注人标准、试样溶液，以色谱峰的保留时间定性、峰面积积分值定量，用标准系列进行单点或多 点校准。样品溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。 3.6试验数据处理 试样中L-肉碱含量以质量分数X，表示，单位为毫克每千克（mg/kg），按式（1)和式（2)计算。 （(1) mX1000 式中： C; 试样溶液中L-肉碱浓度，单点校准时由式（2）计算得到，多点校准时从标准曲线查得， 单位为微克每毫升（ug/mL）； V 试样的提取液总体积，单位为毫升（mL）； n 稀释倍数； m 试样的质量，单位为克（g）； 0.815 -L-肉碱与L-肉碱盐酸盐的换算关系。 As (2) 式中： C—混合标准工作液中L-肉碱浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）； A试样溶液中L-肉碱的峰面积； A—混合标准工作液中L-肉碱的峰面积。 测定结果用平行测定的算术平均值表示，结果保留3位有效数字。 如需分析饲料中L-肉碱是否含有D-肉碱成分，可参考附录A的方法进行分离鉴别。 3.7精密度 在重复性条件下，获得的2次独立测定结果与其算术平均值的绝对差值不得超过算术平均值的 10%。以大于10%的情况不超过5%为前提。 4第二法液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS) 4.1原理 2 NY/T3321—2018 用盐酸溶液提取样品中的L-肉碱，用固相萃取柱净化后，使用液相色谱串联质谱分离测定，内标法 定量。 4.2试剂或材料 除方法另有规定外，试剂均为分析纯，实验室用水符合GB/T6682中一级水的规定。 4.2.1乙睛：色谱纯。 4.2.2甲酸：色谱用。 4.2.3L-肉碱-D3盐酸盐对照品：纯度> 4.2.4L-肉碱盐酸盐对照品：纯度 ≥98% 4.2.5Clg固相萃取柱：3ml 60mg PUBL 4.2.60.3%甲酸溶液： 夜甲酸 mL 4.2.7 稀释液：取0. 酸溶液2. Pml 4.2.8L-肉碱盐酸 盐标 准储备液( 圭确称取 肉砖 用甲醇配制成100μg/ mL的标准储备液 避光保 有效期为12个月。 备浴液( 肉碱盐 校盐标准 9),用甲醇稀释 成1μg/mL, 避光保有 有效期为 S 4.2.10L-肉碱盐 酸盐标 准工作浴液根据需要 分别吸取标准中间液 o 适 量，用稀释液 (4.2.8)稀释成浓度为% ug/mL aigml ug/mE g/ AL、 mL的标准 工作溶液，现配现 4.2.11L-肉碱 gL) 准确称取L肉碱DS 醇配制成100 Lg mL的内标储备液18℃避光保存备用，有效期为12个月 工 4.2.12L-肉碱 12),用甲醇 稀释成1μg/m 4.3仪器设备 4.3.1实验室常用仪 义器/设 4.3.2 电子天平：感 9 4.3.3 离心机：可达 000k/ming 4.3.4 超声水浴。 4.3.5 固相萃取装置。 4.3.6 高效液相色谱串联质谱仪：配电喷雾离子源（ES） 4.3.7 氮吹装置。 4.3.8 有机滤膜：0.22μm。 4.4样品 同3.4。 4.5试验步骤 4.5.1试样提取 称取饲料试样2g（精确到0.001g），置于50mL离心管中，准确加人盐酸溶液20mL，充分摇动 30s，再置于超声水浴中超声提取20min，期间摇动2次。取出后，于离心机上5000r/min离心5min， 准确吸取上清液1mL，加入L-肉碱-D3内标工作液（4.2.13)10μL，用稀释液定容至10mL，作为净化 备用液。 4.5.2试样净化 NY/T3321—2018 滤液1mL～2mL，收集剩余流出液至10mL试管内，过0.22um滤膜后，上机测定。若样品液中含有的 药物浓度超出线性范围，进样前用一定体积的稀释液稀释，使稀释后上机液中的药物浓度在线性范 围内。 4.5.3测定 4.5.3.1液相色谱参考条件 色谱柱：非抑制性阳离子交换分离柱（长250mm，内径4mm)或性能相当的其他分析柱。 柱温：30℃。 流动相：0.3%甲酸溶液：乙腈=90：10。 流速：0.80mL/min。 进样量：10μL。 4.5.3.2质谱参考条件 离子源：电喷雾离子源。 扫描方式：正离子扫描。 检测方式：多反应监测MRM。 使用前，应调节各气体流量，以使质谱灵敏度达到检测要求。 质谱参数应优化至最佳 定性离子对、定量离子对及碰撞能量的参考值见表1。 表1L-肉碱的定性、定量离子对及碰撞能量的参考值 名称 定性离子对，m/2 定量离子对，m/2 参考碰撞能量eV 163.2/102.9 12 L-肉碱 163.2/102.9 163.2/93.2 15 L-肉碱-D3 165/105.1 165/105.1 12 4.5.3.3定性测定 每种被测组分选择1个母离子、2个以上子离子，在相同试验条件下，样品中待测物质的保留时间 与标准溶液中对应的保留时间偏差在土0.5之内，且样品谱图中各组分定性离子的相对丰度与浓度接 近的标准溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，若偏差不超过表2规定的范围，则可判定为样品 中存在对应的待测物， 表2定性确证时相对离子丰度的最大允许误差 单位为百分率 相对离子丰度 >50 20~50（含） 10~20（含） o1> 允许的最大偏差 ±30 ±30 ±30 ±30 4.5.3.4定量测定 在仪器最佳工作条件下，取试样溶液和标准溶液分别进样，以标准溶液中被测组分峰面积为纵坐 标、被测组分浓度为横坐标，用标准系列进行单点或多点校准，采用内标法对样品进行定量。样品溶液 中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内，以L-肉碱-D3为内标物计算L-肉碱含量。上述色 谱和质谱条件下，L-肉碱以及内标物L-肉碱-D3标准物质的多反应监测色谱图参见附录B。 4.6试验数据处理 试样中L-