ICS 67.100.10 X 16 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3313—2018 生乳中β一内酰胺酶的测定 Determination of β-lactamase in raw milk 2018-12-19发布 2019-06-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 NY/T3313—2018 前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由农业农村部畜牧兽医局提出。 本标准由全国畜牧业标准化技术委员会（SAC/TC274)归口。 本标准起草单位：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所、农业农村部奶产品质量安全风险评估实验 室（北京）、农业农村部奶及奶制品质量监督检验测试中心（北京）。 本标准主要起草人：郑楠、刘慧敏、屈雪寅、王加启、李松励、杨晋辉、赵晨、文芳、祝杰妹、叶巧燕。 I NY/T3313—2018 生乳中β-内酰胺酶的测定 1范围 本标准规定了生乳中β-内酰胺酶测定的杯碟法和胶体金快速试纸条法。 本标准适用于生牛乳、生羊乳、生水牛乳中β-内酰胺酶的测定。 本标准第一法检出限为生牛乳4U/mL、生羊乳3U/mL生水牛乳1U/mL；第二法检出限为4 U/mL。 2规范性引用文件 下列文件对于本 仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的 版本（包括） 的修改 GB/T6682 实验空用 和试验方法 NY/T305 祥品处 人 S AL 3原理 采用对青霉 紫药物 感的藤黄微球菌通过舒巴坦特异性抑制β内酰 以青霉素作 为对照，比较加 未加人舒巴坦的样品产生的抑菌圈大小，间接测 祥品电 舒口墙 中是否含有β-内 酰胺酶。 工 L 4试剂或材料 U 除非另有夫 4.1水:GB/T 4.2磷酸盐缓冲 磷酸氢钾2.0g无水磷酸 解于水中，用盐酸 溶液(0.1mol/L)调 屋 高压灭菌15mil 4.3生理盐水（8.5g 称取 氯化 钠，溶解 FL水中121C 高压灭茵 5min。 4.4菌悬液：将试验菌株 藤黄微球菌 icroc GMCC(B 01，又名嗜根考克氏菌 (Kocuria rhizophila)CICC 15接种手 营养琼脂培养 （4.8）斜 2，经生化培养箱（5.1)培养 18h～24h，用生理盐水（4.3)洗下菌苔即为菌悬液。菌悬液浓度用光度计测定，在450nm测量其200 倍稀释液，吸光度值约为0.89，即终浓度为1X10CFU/mL。菌悬液现用现配。 4.5β-内酰胺酶标准溶液（4000U/mL)：用磷酸盐缓冲液（4.2)将β-内酰胺酶标准品（300万U/mL） 制备成浓度为4000U/mL的标准溶液。现用现配。 4.6舒巴坦标准溶液（1mg/mL）：准确称取10mg(精确至0.1mg）舒巴坦标准物质，用磷酸盐缓冲液 （4.2)溶解并定容至10mL。现用现配。 4.7青霉素标准溶液（0.1mg/mL）：准确称取10mg（精确至0.1mg）青霉素参考标准物质（Penicillin GSodium，青霉素G钠盐），用磷酸盐缓冲液（4.2)溶解并定容至100mL。现用现配。 4.8营养琼脂培养基：见附录A中的A.1。 4.9抗生素检定培养基Ⅱ：见A.2。 1 NY/T3313—2018 5仪器设备 5.1生化培养箱：土1℃。 5.2高压灭菌锅。 5.3光度计：450nm。 5.4pH计：精确至0.1。 5.5移液器：1mL，200μL，10μL。 5.6天平：感量0.1mg。 5.7 恒温水浴锅：土1℃。 5.8# 抑菌圈测量仪或游标卡尺：精确至0.01mm。 5.9牛津杯：不锈钢小管，外径（8.0士0.1)mm，内径（6.0士0.1)mm，高度（10.0土0.1)mm。 5.10 ）培养皿：内径90mm。 5.11离心管：1.5mL。 6样品 样品应按NY/T3051一2016中3.4.5规定的要求冷藏或冷冻保存，恢复室温后进行测定。 7试验步骤 7.1检验用平板的制备 将菌悬液（4.4)按适当比例加入灭菌后冷却至（46士1)℃的抗生素检定培养基Ⅱ（4.9)中，充分摇匀 后制备菌体数量约为1×10°CFU/mL的含菌培养基；取15mL～20mL含菌培养基倒入无菌培养血 （5.10），凝固后备用。 7.2试样的测定 各取1.00mL充分混匀的生乳于4个1.5mL离心管（5.11)中，分别标为A、B、C、D。每个样品平 行试验2个。同时，用灭菌水作空白试验。按照表1依次分别加人β-内酰胺酶标准溶液（4.5）、舒巴坦 标准溶液（4.6）、青霉素标准溶液（4.7）。混匀后，取AD试样各200μL分别加人到放置于检验用平 板（7.1)上的4个牛津杯(5.9)中，平板加盖后放人（37土1)℃生化培养箱（5.1)中培养18h～22h，测量 各抑菌圈直径，取2个平行测定结果的平均值。 表1试样的添加 离心管编号 β-内酰胺酶标准溶液 舒巴坦标准溶液 青霉素标准溶液 A 5 μL B 25 μL 5 μL c 25 μL 5 μL D 25 μL 25μL 5 μL 8 试验数据处理 8.1空白试验结果 对样品结果进行判定时，空白试验结果应同时满足以下条件： a)2 2次平行测定应同时满足A、B、D均产生抑菌圈； b）2次平行测定应同时满足A与B的抑菌圈差异<3mm； c)2 2次平行测定应同时满足C的抑菌圈小于D的抑菌圈，差异≥3mm。 2 NY/T3313—2018 8.2结果判定 当空白试验结果满足8.1时，样品结果应按以下规则进行判定： a）若B和D均产生抑菌圈，且C的抑菌圈小于D的抑菌圈，差异≥3mm时： 1）A的抑菌圈小于B的抑菌圈，2次平行测定同时满足抑菌圈差异≥3mm时，该结果判定 为检出β-内酰胺酶； 2）2次平行测定同时满足A的抑菌圈与B的抑菌圈差异<3mm时，该结果判定为未检出 β-内酰胺酶； b）若A和B均不产生抑菌圈，应将样品稀释后再重新进行测定。 二法胶体金快速试纸条注 9原理 通过测定样品中被 是否含有β-内酰胺酶。 10 试剂或材料 除非另有规定， 使用分机 纯试剂 体储存要求参照使用 说明，试剂盒内包括 人 青霉 或食 a) 微 b）金标颗粒 立青霉素 体试剂微手 c）胶体 式纸歪。 金 所用的商品 化内 酰胺酶胶体金试剂盒 U 11仪器设备 11.1孵育器 0±2) 11.2读数仪 测定 昆示胶体金试纸条 11.3移液器 12样品 R 样品应按NY 冷冻保存 后进行测定。 13 试验步骤 将β-内酰胺酶胶体金试剂盒充分回温 吸取200m 试样于青霉素 散孔或试剂瓶中，每个样品平 行试验2个。充分混匀后，置于事前预热好的孵育器（11.1)中孵育 育后，将全部试液转移至受体试 剂微孔中，充分混匀后再次置于孵育器(11. 中孵育。孵育后，将对应的试纸条吸水端插人于微孔中，3 min后弃去吸水纸并观察结果 注：不同β-内酰胺酶胶体金试剂盒制造商间的产品组成和孵育时间有差异，应按照说明书操作。 14试验数据处理 结果按以下2种方式进行判定： a）肉眼判定：通过比较控制线（C线）与测试线（T线）的颜色进行结果判定（见图1），判定时间不 超过5min。 1 阴性（一）：控制线（C线）显色，且测试线（T线）显色比C线浅或不显色，表示试样中不含 β-内酰胺酶或β-内酰胺酶的浓度低于检出限； 3 NY/T3313—2018 2） 阳性（十）：控制线（C线）显色，且测试线（T线）显色等于或者强于C线显色，表示试样中 含β-内酰胺酶且浓度高于检出限，阳性样品或疑似阳性样品应按本标准第一法确证； 3） 无效：控制线（C线）不显色，表明试验失效，应重新进行测试。 标记区 控制线（C线） 测试线（T线） 吸水区 阴性 阳性 无效 图1胶体金试纸条结果判定 b）读数仪判定：参照读数仪（11.2)厂家的建议对结果进行判定，阳性样品或疑似阳性样品应按本 标准第一法确证。 注：不同厂商读数判定结果有差别，应按照说明书操作及判定。 NY/T3313—2018 附录A （规范性附录） 培 养基 A. 1 营养琼脂培养基 见表A.1。 表A.1 营养琼脂培养基的配制 成分 质量或体积 蛋白陈 10 g 牛肉膏 3g 氯化钠 5 g 琼脂 15 g~20 g 水 1 L 注：分装试管每管5mL~8mL，121℃高压灭菌15min，灭菌后摆放斜面 A. 2 抗生素检定培养基Ⅱ 见表A.2。 表A.2 抗生素检定培养基Ⅱ的配制 成分 质量或体积 蛋白陈 10 g 牛肉浸膏 3g 氯化钠 5g 酵母膏 3g 葡萄糖 1g 琼脂 14 g 水 1L 注：121℃高压灭菌15min，其最终pH为6.5~6.6。 5