ICS 67.120 B 45 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3309—2018 肉类源性成分鉴定 实时荧光定性PCR法 Identification of animal-derived materials in meat- QualitativerealtimePCRmethod 2018-12-19发布 2019-06-01实施 中华人民共和国农业农村部发布 NY/T3309—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由农业农村部畜牧兽医局提出。 本标准由全国畜牧业标准化技术委员会（SAC/TC274)归口。 本标准起草单位：山东省农业科学院生物技术研究中心、山东省食品药品检验研究院。 本标准主要起草人：步迅、张全芳、刘艳艳、范阳阳、霍胜楠、张卉、马德源、下如如、陈杰、杨雪、李燕、 杨连群。 I NY/T3309—2018 肉类源性成分鉴定 实时荧光定性PCR法 1范围 本标准规定了对羊（绵羊、山羊）、狐狸、鸡、牛（普通牛、黄牛）、马、鸭、水貂、猪和大鼠9种动物源性 成分进行鉴定的实时荧光PCR法。 本标准适用于生鲜肉、冷冻肉及肉制品中羊（绵羊、山羊）、狐狸、鸡、牛（普通牛、黄牛）、马、鸭、水貂、 猪和大鼠9种动物源性成分的鉴 本方法检出限为1%。 2规范性引用文件 下列文件对于本 是 件。凡是不注日期的引 用文体真 最新版 本（包括所有的修改单 GB/T6682 析实验室 用水规格和试验方 GB/T969 内与肉制品取样方送 GB/T 27 实验室 食品分 生物学检测 农业部24 2016 转基因动物及具 品成分检测 DNA提 RCH 3术语和定义 下列术语和 3. 1 CE 实时荧光PCR 在PCR反应件 系中加人荧光基因.利用荧 进程 未知模板进行定 性或定量分析。 R 3. 2 id Ct值cycle thresh 每个反应管内的荧光信号 达到设定的國值时所经历的循环数 4原理 根据线粒体16SrDNA基因在不同物种间保守区设计通用引物， 在可变区设计物种特异性探针，采 用TaqMan实时荧光PCR技术进行搅增，根据PCR扩增反应的荧光信号及循环阈值，判定羊（绵羊、山 羊）、狐狸、鸡、牛（普通牛、黄牛）、马、鸭、水貂、猪和大鼠9种动物源性成分。 5试剂或材料 除另有规定外，仅使用分析纯试剂。 5.1水：GB/T6682，一级。 5.2生理盐水：称取0.85gNaCl加20mL水溶解，然后加水定容至100mL，103.4kPa蒸汽压（121℃） 条件下灭菌20min。 5.31mol/LTris-HCl(pH6.4)溶液：称取12.1gTris置于100mL烧杯中，加人80mL水，用浓HCl 调节pH至6.4，加水定容至100mL，103.4kPa蒸汽压（121℃)灭菌20min，室温保存待用 NY/T3309—2018 5.410mol/LNaOH溶液：称取80gNaOH溶解于160mL水中，冷却至室温，再加水定容至200mL。 5.50.5mol/LEDTA-Naz（pH8.0）溶液：称取18.6gEDTA-Na2溶解于70mL水中，用10%的 NaOH溶液，调节pH至8.0，加水定容至100mL，103.4kPa蒸汽压（121℃）条件下灭菌20min，室温保 存待用。 5.610%十二烷基磺酸钠(SDS)溶液：称取10gSDS溶解于80mL灭菌水中，加热至完全溶解后，冷 却至室温，加水定容至100mL，103.4kPa蒸汽压（121℃）灭菌20min，室温保存待用。 5.75mol/LNaCl溶液：称取29.22gNaCl溶解于80mL无菌水中，加水定容至100mL，103.4kPa 蒸汽压（121℃）灭菌20min，室温保存待用。 5.8细胞裂解液(LysisBuffer)：取1mol/LTris-HCl(pH8.0)溶液20mL0.5mol/LEDTA(pH 8.0)溶液5mL，5.0mol/LNaCl溶液10mL10%SDS溶液5mL，加水定容至100mL，混匀。 5.920mg/mL蛋白酶K溶液：称量0.2g蛋白酶冻干品，加无菌水溶解，加水定容至10mL，分装后于 一20℃保存。 5.10RNA酶溶液：将1g冻干品RNA酶A溶解于6mL无菌水中，于100℃加热15min，缓慢冷却至 室温，加水定容至10mL，分装成小份存于一20℃。 5.11氯仿十异戊醇混合液：将氯仿和异戊醇按照24十1的体积比例配制。 5.1270%乙醇：量取70mL无水乙醇，加人30mL水。 5.13TE缓冲液：将0.5mL的10mmol/LTris-HCl(pH8.0)溶液、0.1mL的0.5mol/LEDTA(pH 8.0)溶液加人到50mL容量瓶中，调pH8.0，加水定容，103.4kPa蒸汽压（121℃)灭菌20min，降至室 温，4℃保存备用。 5.14羊（绵羊、山羊）、狐狸、鸡、牛（普通牛、黄牛）、马、鸭、水貂、猪和大鼠9种动物源性实时荧光PCR 检测试剂盒试剂：2XTaqManMasterMix，含有TaqDNA聚合酶（终浓度1U/20μL）、Mg²+（终浓度 2.0mmol/μL）、dNTPs（终浓度0.2mmol/μL）。羊（绵羊、山羊）、狐狸、鸡、牛（普通牛、黄牛）、马、鸭、水 貂、猪和大鼠9种动物源性基因组DNA阳性标准品。 6仪器设备 6.1实时荧光定量PCR仪：4通道以上。 6.2紫外分光光度计：波长190nm~900nm。 6.3分析天平：感量0.1mg。 6.4台式离心机、低温离心机：13000g。 6.5水浴锅。 6.6高压灭菌锅。 6.7 冰箱：-20℃~4℃。 01~ 02~z00z~01 000~00189 7检测用引物和探针 内参引物探针序列及羊（绵羊、山羊）、狐狸、鸡、牛（普通牛、黄牛）、马、鸭、水貂、猪和大鼠9种动物 的通用引物和特异性探针序列见附录A中的表A.1。引物探针在序列中的位置参见附录B。 8试验步骤 8.1取样 对鲜肉、冻肉及肉制品的取样方法按GB/T9695.19的规定执行。 2 NY/T 3309—2018 8.2试样制备 8.2.1整块肉，取3g肉块，用生理盐水（5.2)清洗，在液氮中研磨成粉末。 8.2.2碎肉、肉片或肉卷等冷冻混合肉，混匀后，称取10g样品，用生理盐水（5.2)清洗，在液氮中研磨 成粉末。 8.3DNA提取 DNA提取及纯化方法按农业部2406号公告一7一2016的规定执行。 8.4实时荧光PCR反应 8.4.1试样实时荧光PCR检测 8.4.1.1多重实时荧光PCR：分 A、B、C3组PCR反应体系进行多重实时荧光PCR。A组包括羊（绵 每组PCR反应体系中包含3种动 物源性的特异探针，并加人内参 表A 8.4.1.2单重实时荧光PCR.9种动物单重 8.4.2对照实时荧光PCR反应体系 在试样PCR反 应的同时设置如工 对照、空白对照利 REs a）阴性对照：以 9种习物之外的动物 DNA 对用 b）空白对照： 以水作为空白对照， c) 阳性对 将羊绵 山羊瓜狸鸡 种动物基因 组DNA 等量混勺作为阳性对照 注：每个POR 反 立设量3次平行 8.4.3实时荧光POR反 分别按照 1.2、表A.3、表A.4和表A.5依次加人试剂配制PCR反应 PCR反应管中 入模板 DNA3000离L1min 汉出PCR 量 PCR仪 8.4.4实时荧光 PCR反应程序 CENTE 95℃预变 min，95C变性1060c退火延伸35 （ 收集荧光信 C 9试验数据处理 9.1对照检测结果分 空白对照、阴性 和阳性 生对照全部满足下 a）空白对照：AB 、D4组PCR体系对应的反应孔均无FAM FOE.C 和CY5荧光的典型扩 增曲线； b) 阴性对照：A、B、C、D4组PCR体系双 过应的反应孔均无FAMJOE、CY3荧光的典型扩增曲 线；而CY5有典型扩增曲线，且Ct值<35.0； c) 阳性对照：A、B、C、D4组PCR体系对应的反应孔中均出现FAM、JOE、CY3和CY5荧光的典 型扩增曲线，且Ct值≤35.0。 9.2样品检测结果分析和表述 9.2.1在PCR反应体系有效且内参基因出现典型扩增曲线（Ct值<35.0)的情况下，当有FAM、JOE、 CY3荧光典型扩增曲线出现，若Ct值<35.0，则判定样品中检出相应的动物源性成分；若无典型扩增曲 线，则判定样品中未检出相应的动物源性成分。 9.2.2在PCR反应体系有效且内参基因出现典型扩增曲线（Ct值<35.0)的情况下，当有FAM、JOE、 CY3荧光扩增曲线出现，但35.0<Ct值<40.0，则需要重新提取DNA加大模板量进行PCR反应。若 再次扩增后的Ct值<40.0，则判定样品中检出相应的动物源性成分；若再次扩增后无典型扩增曲线，则 判定样品中未检出相应的动物源性成分。 3 NY/T3309—2018 9. 2. 3 3对各种样品检测结果的判定，见表A.6。 10 检测过程中防止交叉污染的措施 按GB/T27403的规定执行。 NY/T3309—2018 附 （规范性附录） 实时荧光定性PCR引物/探针序列、反应体系和结果判定 A. 1 实时荧光定性PCR引物和探针序列 见表A.1。 表A.1 实时荧光定性PCR引物/探针序列 扩增片段 引物探针名称 缩写 序列（5—3'） bp 通用引物上游 UNF AAGACGAGAAGACCCTTGGACTTTA 通用引物下游 UNR GATTGCGCTGTTATCCCTAGGGTA 228~241 内参引物上游 16SF CCTA