ICS 65.020.01 B 04 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3300—2018 植物源性油料油脂中甘油三酯的测定 液相色谱一串联质谱法 Determination of triacylglycerols in oilseeds and vegetable oils- Liquid chromatography tandem mass spectrometry 2018-07-27 发布 2018-12-01实施 中华人民共和国农业农村部发布 NY/T 3300—2018 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由农业农村部种植业管理司提出并归口。 本标准起草单位：中国农业科学院油料作物研究所、安徽燕庄油脂有限责任公司、农业农村部油料 产品质量安全风险评估实验室（武汉）、农业农村部油料及制品质量监督检验测试中心。 本标准主要起草人：王秀嫔、李培武、刘燕、徐彦辉、马飞、印南日、汪雪芳。 I NY/T 3300—2018 植物源性油料油脂中甘油三酯的测定 液相色谱-串联质谱法 1范围 本标准规定了植物源性油料油脂中甘油三酯的测定方法。 (OLL)、1-棕榈酸-2,3-亚油酸甘油酯(PLL)、1-棕榈酸-2 -油酸- -亚油酸甘油酯(POL)、三油酸甘油 酯(O0O)、1,2 -油酸-3-棕榈酸甘油酯(OOP)的测定 本标准方法的检出限均为0 TSHIN 本标准方法的线性范围为 0.2 2规范性引用文件 凡是注日期的引用 月的版本适用于本文 最新版本 的修改 GB5491粮食、 、油料检验 托样分样 GB/T5524 动植物油脂 扦样 GB/T6682 分析实验室 用水规格和试验方法 RA 3方法原理 植物源性油料油 酯用有机溶剂提取 后，取上清液过有机相滤膜， 用液相 色谱-串联质 谱仪选择反应监测（S RMD模 工 CENTE 4 试剂与材料 除非另有说明 纯 682规定 4.1 异丙醇(C:Hs( 4. 2 正已烷（CH14） 4. 3 异丙醇十正已烷 容液 汉5 （4.2），混匀。 4. 4 三亚油酸甘油酯(LL 标准品： 98 4. 5 51-油酸-2,3-亚油酸甘 油酯(OLL)标品 量 4.61-棕榈酸-2,3-亚油酸甘油 PLL)标准 4.7 1-棕榈酸-2-油酸-3-亚油酸甘油酯(POL)标准品:含量≥98 4.8 三油酸甘油酯(000)标准品:含量≥98. 4. 9 91,2-油酸-3-棕榈酸甘油酯(OOP)标准品：含量≥98.0%。 4. 10 乙腈(C,HN):色谱纯。 4. 11 甲酸(HCOOH):色谱纯。 4. 12 甲酸铵（HCOONH4)：含量≥98.0%。 4. 13 正已烷-异丙醇-乙腈混合溶液（40十40+20，V/V/V）：取40mL异丙醇（4.1)加40mL正已烷 （4.2），用乙腈（4.10)定容到100mL，混匀。 4.14异丙醇-乙腈混合溶液（90+10,V/V）：取900mL异丙醇（4.1)，用乙腈（4.10）定容到1000mL， 混匀。 1 NY/T 3300—2018 4.15乙腈-水混合溶液（60十40，V/V）：取600mL乙（4.10），用水定容到1000mL，混匀。 4.16异丙醇-乙腈混合溶液（90+10,V/V)含10mmol/L甲酸铵和0.1%甲酸（V/V）：称取630mg（精 确到1.0mg）甲酸铵（4.12）加人到1L棕色容量瓶（5.8）中，再加人1mL甲酸（4.11），用异内醇-乙腈混 合溶液（4.14)定容到1L。 4.17乙腈-水混合溶液（60十40,V/V)含10mmol/L甲酸铵和0.1%甲酸(V/V）：称取630mg(精确到 1.0mg)甲酸铵（4.12)加人到1L棕色容量瓶（5.8)中，再加人1mL甲酸（4.11)，用乙腈-水混合溶液 (4.15)定容到1L。 4.18单一标准储备溶液：分别称取100.0 mg 三亚油酸甘油酯(LLL)、1-油酸-2,3-亚油酸甘油酯 (OLL)、1-棕榈酸-2,3-亚油酸甘油酯(PLL)、1-棕榈酸-2-油酸-3-亚油酸甘油酯(POL)、三油酸甘油 酯(OOO)、1,2-油酸-3-棕榈酸甘油酯（OOP)6种标准品，用异丙醇十正已烷混合溶液（4.3)溶解， 10mL棕色容量瓶(5.8)定容至刻度，分别配制成浓度为10.0mg/mL的单一标准储备溶液，一20℃以 下避光保存。 4.19混合甘油三酯标准储备液：分别量取6种单一标准储备溶液(4.18)1mL，于10mL棕色容量瓶 (5.8)中，用异丙醇（4.1)稀释至刻度，配制成浓度为100.0μg/mL的混合标准工作溶液，一20℃以下避 光保存。 4.20混合甘油三酯标准工作溶液：分别吸取一定量的混合标准储备液（4.19），用异丙醇（4.1)稀释成 浓度分别为2.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL和40.0μg/mL的混合标准工作溶液。 现用现配。 5仪器和设备 5.1液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源(ESI)。 5.2分析天平：感量±1mg，感量±0.01mg。 5.3涡旋振荡器。 5.4氮吹仪。 5.5离心机：带有10mL转头，并能获得对应转速4500r/min的相对离心力。 5.6微孔滤膜：0.22μm，有机系。 5.710mL尖底玻璃试管。 5.810mL、100mL和1L的棕色容量瓶。 5.95mL具塞离心管。 5.10超声提取仪。 5.11粉碎机。 6试样制备 密闭容器内。油脂样品按照GB/T5524的规定进行扦样和取样。 7分析步骤 7.1油料试样前处理 称取1g(精确至0.01g)油料试样至10mL尖底玻璃试管(5.7)中，加入5mL正已烷（4.2)，超声提 取20min(20℃条件下），4500r/min离心3min，准确取出4mL提取液，N²吹干，用100mL正已烷-异 丙醇-乙混合液（4.13）复溶，涡旋1min后，取1mL复溶液用正已烷-异丙醇-乙腈混合液（4.13）定容 2 NY/T 3300—2018 到100mL,定容液通过有机相滤膜(5.6)过滤，供LC-MS/MS分析。 7.2植物油试样前处理 量取0.01g(精确至0.0001g)植物油试样置于10mL的棕色容量瓶（5.8)中，将正已烷-异丙醇-乙 混合液（4.13)作为提取溶液稀释植物油试样到10mL，用涡旋振荡器混匀，静置30min，取上清液通 过微孔滤膜(5.6)过滤。吸取100μL上清液，用异丙醇(4.1)稀释定容至10mL的棕色容量瓶中。供 LC-MS/MS 分析。 7.3测定 7.3.1液相色谱参考条件 色谱柱:C8(150mmX2.1mm,3.0um)或性能相当者 流动相A：异丙醇-乙腈混合溶液（90+10,V/V） 1/L甲酸铵和0.1%甲酸(V/V)。 甲酸铵和0.1%甲酸(V/V)。 进样量：10μL。 柱温：30℃。 流动相梯度洗脱程 序见美 流动相梯度洗脱程序 时间,min 动相A，% 流动相B min 0 FURAL 3 10 10. 1 15 7.3.2 质谱参考条 质 质谱仪：三重四极 离子源：电喷雾 子源 离子源温度：300 离子传输毛细 喷雾气压力：30 R 辅助气压力：5psi 吹扫气流量：5psi。 扫描模式：正离子扫描 检测方式：选择离子监测(SRM)。 6种甘油三酯定量离子和定性离子参考质谱条件见表 表 26 种甘油三酯定量离子和定性离子参考质谱条件 保留 母离子 时间 特征子离子 碰撞能量 化合物 [M+NH] m/ z eV min m/z 三亚油酸甘油酯(LLL) 8.50 896.8 599.5337.3 27 1-油酸-2,3-亚油酸甘油酯(OLL) 9.15 898.8 *599.5339.3 24 1-棕榈酸-2,3-亚油酸甘油酯(PLL) 9.18 872.8 *599.5575.5 30 1-棕榈酸-2-油酸-3-亚油酸甘油酯(POL) 9. 79 874. 8 *601.5577.5 25 三油酸甘油酯（OOO） 10.33 902.82 *603.5339.3 26 1,2-油酸-3-棕榈酸甘油酯(OOP) 10.38 876.80 577.5603.5 31 *为定量离子。 3 NY/T 3300—2018 7.3.3定性测定 在相同试验条件下,待测物在样品中的保留时间与标准工作溶液中的保留时间偏差在士0.25min 之内；并且色谱图中各组分定性离子对的相对丰度，与标准工作液中相应定性离子对的相对丰度进行比 较,若偏差不超过表3规定的范围,则可判断为样品中存在对应的待测物。6种甘油三酯标准工作液的 二级质谱图参见附录A。 表3定性测定时相对离子丰度的最大允许误差 相对离子丰度 >50 >20~50 >10~20 ≤10 允许的相对偏差 ±20 ±25 ±30 09干 7.3.4定量测定 取混合标准工作液与试样交替进样，采用单点或多点校准，外标法定量。当试样的上机液浓度超过 线性范围时,需根据测定浓度,稀释后进行重新测定。三亚油酸甘油酯(LLL)、1-油酸-2,3-亚油酸甘 油酯(OLL)、1-棕榈酸-2,3-亚油酸甘油酯(PLL)、1-棕榈酸-2-油酸-3-亚油酸甘油酯(POL)、三油酸 甘油酯(OOO)、1,2-油酸-3-棕榈酸甘油酯(OOP)标准溶液的选择离子监测色谱图参见附录 A。 8 结果计算 cXV (1) m 式中: 样品中甘油三酯含量,单位为毫克每克(mg/g)； 样液中甘油三酯质量浓度,单位为微克每毫升(μg/mL)； 稀释液定容