ICS 65.020.01 B 04 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3296—2018 油菜籽中硫代葡萄糖苷的测定 液相色谱一串联质谱法 Determination of glucosinolate compounds in rapeseeds- Liquid chromatography mass spectrometry 2018-07-27 发布 2018-12-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 NY/T 3296—2018 前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由农业农村部种植业管理司提出并归口。 本标准起草单位：中国农业科学院油料作物研究所、农业农村部油料产品质量安全风险评估实验室 （武汉）、农业农村部油料及制品质量监督检验测试中心。 本标准主要起草人：李培武、王秀嫔、马飞、印南日、张文、汪雪芳、胡为 I NY/T 3296—2018 油菜籽中硫代葡萄糖苷的测定液相色谱-串联质谱法 1 范围 本标准规定了采用高效液相色谱-串联质谱法测定油菜籽中硫代葡萄糖苷含量的方法。 本标准适用于油菜籽中硫代葡萄糖苷含量的测定。 本标准方法油菜籽中硫代葡萄糖苷的检出限为 0.1 μumol/g。 2规范性引用文件 DU 件。凡是不注日期的引用文件， GB 5491粮食、油料检验 Q GB/T6682 分 实！ 金室用水规 万法 GB/T 14488. 油量测定 GB/T 14489. 分及挥 物含量测定 S 3方法原理 L 样品中的硫代葡 萄糖香 甲醇 浴 选择 （SRM)模式测 定硫代葡萄糖苷，内标法量 U 4 试剂与材料 除非另有说明 4.1甲醇(CH:OH) 色谱纯 4.2 乙腈(CH:CN 4.32-丙烯基硫代 4.4苯甲基(苄基)硫代 萄糖苷 4.5 2-羟基-3-丁烯基硫代葡葡糖 4.6反式-2-羟基-3-丁烯基硫代葡萄米 4.74-甲亚砜丁基硫代葡萄糖苷标准品：含 4.82 -羟基-4-戊烯基硫代葡萄糖 准品：含量≥98.0%。 4.95-甲亚矾戊基硫代葡萄糖苷标准品： 00 4.103-丁烯基硫代葡萄糖苷标准品：含量≥98.0%。 4.114-羟基-3-吲哚甲基硫代葡萄糖苷标准品：含量≥98.0%。 4.124-戊烯基硫代葡萄糖苷标准品：含量≥98.0%。 4.133-吲哚甲基硫代葡萄糖苷标准品：含量≥98.0%。 4.14苯乙基硫代葡萄糖苷标准品：含量≥98.0%。 4.154-甲氧基-3-吲哚甲基硫代葡萄糖苷标准品：含量≥98.0%。 4.161-甲氧基-3-吲哚甲基硫代葡萄糖苷标准品：含量≥98.0%。 4.17甲醇-水混合溶液（70十30)：量取70mL甲醇和30mL水混合。 1 NY/T 3296—2018 4.18硫代葡萄糖苷单一标准储备溶液：分别称取标准品2-羟基-3-丁烯基硫代葡萄糖苷、反式-2-羟 基-3-丁烯基硫代葡萄糖苷、丙烯基硫代葡萄糖苷、4-甲亚砜丁基硫代葡萄糖苷、2-羟基-4-戊烯基硫代 葡萄糖苷、5-甲亚矾戊基硫代葡萄糖苷、3-丁烯基硫代葡萄糖苷、4-羟基-3-吲哚甲基硫代葡萄糖苷、 4-戊烯基硫代葡萄糖苷、苯甲基(苄基)硫代葡萄糖苷、3-吲哚甲基硫代葡萄糖苷、苯乙基硫代葡萄糖 苷、4-甲氧基-3-吲哚甲基硫代葡萄糖苷、1-甲氧基-3-吲哚甲基硫代葡萄糖苷10.0mg（精确至0.1 mg),用甲醇-水混合溶液(4.17)作溶剂溶解定容至10mL。此标准溶液浓度为1.0mg/mL。溶液转移 至棕色玻璃瓶中后，在一20℃冰箱内保存，备用。 4.19内标溶液 4.19.15mmol/L丙烯基硫代葡萄糖苷内标溶液：精密称取207.70mg丙烯基硫代葡萄糖苷溶解于 80mL水中，加水定容到100mL。 4.19.25mmol/L苯甲基硫代葡萄糖苷内标溶液：精密称取223.7mg苯甲基硫代葡萄糖苷溶解于80 mL水中,加水定容到100mL。 注：用丙烯基硫代葡萄糖苷作为内标，当样品中含有丙烯基硫代葡萄糖苷时，用苯甲基硫代葡萄糖苷作内标。 4.20混合标准工作溶液：分别吸取2-羟基-3-丁烯基硫代葡萄糖苷、反式-2-羟基-3-丁烯基硫代葡 萄糖苷、丙烯基硫代葡萄糖苷、4-甲亚砜丁基硫代葡萄糖苷、2-羟基-4-戊烯基硫代葡萄糖苷、5-甲亚砜 戊基硫代葡萄糖苷、3-丁烯基硫代葡萄糖苷、4-羟基-3-吲哚甲基硫代葡萄糖苷、4-戊烯基硫代葡萄糖 苷、苯甲基(苄基)硫代葡萄糖苷、3-吲哚甲基硫代葡萄糖苷、苯乙基硫代葡萄糖苷、4-甲氧基-3-吲哚甲 基硫代葡萄糖苷、1-甲氧基-3-吲哚甲基硫代葡萄糖苷单一标准储备溶液(4.18)50μL和内标标准工作 溶液（4.20)50μL，用甲醇-水混合溶液（4.17)稀释至1mL，配制成混合标准工作溶液。 5仪器和设备 5.1液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源(ESI)。 5.2分析天平：感量±0.01mg和±0.1mg。 5.3涡旋振荡器。 5.4低温冰箱：温度可低至一20℃。 5.5离心机：带有10mL转头，并能获得对应转速5000r/min的相对离心力。 5.6微孔滤膜:0.22μm,有机系。 5.7棕色容量瓶：10mL和100mL。 5.8离心管：10mL。 5.9刻度试管:10mL。 6试样制备与保存 6.1试样制备 试样应在45℃条件下通风干燥，保证水分及挥发物含量不超过10%。按照GB5491的规定对试验 材料进行缩分，将缩分后的实验材料分成三份，第一份按GB/T14489.1的规定测定水分及挥发物含 量，第二份按GB/T14488.1的规定测定含油量，第三份为硫代葡萄糖苷待测试样。 将干燥待测试样在微型粉碎机中粉碎，过40目筛，然后立即连续完成7.1～7.2的全部过程。 6.2保存 试样于干燥器中保存。 7分析步骤 7.1称样 2 NY/T 3296—2018 称取0.2g(精确至0.001g)试样至10mL离心管(5.8)中。 7.2硫代葡萄糖苷的提取 提取液甲醇-水混合溶液(4.17)预先在100℃水浴中预热至沸腾 将装有试样的10mL离心管放于75℃水浴1min,加人2mL沸腾后的甲醇-水混合溶液(4.17)后， 立即加人200μL的5mmol/L内标溶液至离心管中。超声提取5min后，取出离心管，4500r/min离心 3min,转移上清液至10mL刻度试管中。重复此提取操作一次，并将两次提取上清液合并至10mL试 管(5.9)中。刻度试管至涡旋振荡器中混匀。提取上清液用微孔滤膜(5.6)过滤，待进样。 7.3空白试验 用相同的样品进行相同的前处理，但不加内标物质，以检查样品中内标物质是否存在。 7.4液相色谱-串联质谱测定 7.4.1液相色谱参考条件 PUBL 色谱柱:UPLCCis（100 um 流动相:A为水,B为甲醇 流速：0.20 mL/min 进样量：10μL; 柱温：30℃。 流动相梯度洗脱程 时间 10 7.4.2质谱参考条 质谱仪：串联质 配置 离子源：电喷雾高 原（ESI 离子源温度：300℃ 离子传输毛细管温度 520 喷雾气压力：30psi； 辅助气压力：5psi; 碰撞能量：30eV； 吹扫气流量：5psi； 扫描方式：负离子扫描； 检测方式：选择离子监测（SRM）。 硫代葡萄糖苷定量离子和定性离子参考质谱条件见表2。 表 2硫代葡萄糖苷定量离子和定性离子参考质谱条件 碰撞 碰撞 序号 分析物中文名称 分析物英文名称 CAS号 定量离子对 能量 定性离子对 能量 eV eV 2-羟基-3-丁烯基硫代葡萄糖苷 Progoitrin 585-95-5 388.0/195.0 19 388.0/259.0 20 2反式-2-羟基-3-丁烯基硫代葡萄糖苷 Epiprogoitrin 19237-18-4388.1/195.0 20 388.1/259.0 19 3 丙烯基硫代葡萄糖苷 Sinigrin 3952-98-5 358.1/195.0 18 358.1/162.0 18 3 NY/T 3296—2018 表2 (续) 碰撞 碰撞 分析物中文名称 分析物英文名称 CAS号 定量离子对 能量 定性离子对 能量 序号 eV eV 4 4-甲亚砜丁基硫代葡萄糖苷 Glucoraphenin 28463-24-3434.1/419.0 20 434.1/259.0 22 5 2-羟基-4-戊烯基硫代葡萄糖苷 Gluconapoleiferin 107657-50-1402.1/259.0 22 402.1/332.0 18 6 5-甲亚砜戊基硫代葡萄糖苷 Glucoalyssin 499-37-6450.0/386.0 23 450.0/285.0 30 7 3-丁烯基硫代葡萄糖苷 Gluconapin 19041-09- -9372.1/195.0 18 372.1/259.0 19 8 4-羟基-3-吲哚甲基硫代葡萄糖苷 4 - Hydroxyglucobrassicin 83327 - 20 - -2463.0/285.0 18 463/267.0 20 9 4-戊烯基硫代葡萄糖苷 Glucobrassicanapin 19041-10 2386.0/259.0 25 386/275.0 20 10 苯甲基(基)硫代葡萄糖苷 Glucotropaeolin 499-26-3 408.1/259.0 20 408.1/275.0 22 11 3-吲哚甲基硫代葡萄糖苷 Glucobrassicin 4356-52-9 447.0/259.0 26 447.0/275.0 21 12 苯乙基硫代葡萄