ICS 07.100.01 B 15 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3293—2018 黄曲霉生防菌活性鉴定技术规程 Technical regulations for activity identification of biocontrol strains against Aspergillus flavus 2018-07-27 发布 2018-12-01实施 中华人民共和国农业农村部发布 NY/T 3293—2018 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由农业农村部种植业管理司提出并归口。 本标准起草单位：中国农业科学院油料作物研究所、国家农业检测基准实验室（生物毒素）、农业农 村部油料产品质量安全风险评估实验室(武汉）、农业农村部油料及制品质量监督检验测试中心。 本标准主要起草人：李培武、张奇、岳晓凤、余秋玉、喻理、白艺珍。 I NY/T 3293—2018 黄曲霉生防菌活性鉴定技术规程 1范围 本标准规定了黄曲霉生防真菌(霉菌及酵母）、细菌和放线菌活性的鉴定方法。 本标准适用于真菌类(霉菌及酵母）、细菌类和放线菌类生防菌对黄曲霉生防活性的鉴定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 GB4789.3食品安全 GB 4789.15 食品安全国家标准 食品微生物学 GB 4789.28 食品安全国家标准 品微生物学检验 和试剂的质量 要求 GB 5009.22 品安 1黄曲霉毒素 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 生物 GB 19489 实验室 安全通用要求 NY/T2310 花生 生黄曲霉侵染抗性鉴定方法 RA 3原理 将生防菌株与 毒黄曲 株共培养，通过测定 生防菌对黄曲霉菌丝生长 泡子 萌发 、侵染及 产毒的抑制率，鉴定 曲霉生区 CE 培养基、试剂及材料 除另有规定外 法所 4.1 PDA 培养基： 4. 2 沙氏液体培养基 4. 3 LB液体培养基:参 4. 4 高氏1号培养基：参 4. 5 吐温水溶液：参见A.5。 4. 60.2%氯化汞溶液:参见 A. 4.7 0.1%次氯酸钠：参见A.7。 4.8 无菌水：121℃灭菌20min，备用。 4. 9 黄曲霉菌株：Aspergillusflauus strain3.4408,能产生黄曲霉毒素Bi、黄曲霉毒素Bz、黄曲霉毒 素 Gi 和黄曲霉毒素 G2 。 4. 10 大肠杆菌菌株:Escherichia coliTOP10F'。 4. 11 待测生防菌株。 5仪器设备 5. 1 生物安全柜：二级。 5. 2 高压灭菌锅。 1 NY/T 3293—2018 5.3恒温恒湿培养箱。 5.4恒温摇床。 5.5烘箱。 5.6高速粉碎机。 5.7生物显微镜：物镜4倍～100倍。 5.8电子天平：感量±0.01g，感量±0.0001g。 5.9 pH计。 5.10无菌锥形瓶:容量 50 mL,容量500mL。 5.11 烧杯：容量100mL。 5.12无菌培养血：内径90mm。 5.13 微量移液器及枪头：10μL,200μL,1mL。 5.14无菌打孔器：内径6mm。 5.15无菌滤纸片：直径6mm,直径9 cm。 5. 16 血球计数板。 5.17直尺：量程20cm。 6 菌种准备 6.1黄曲霉菌饼准备 生物安全柜中接种黄曲霉菌株于平板PDA培养基上，30℃、相对湿度90%、黑暗培养4d,用无菌 打孔器在菌落边缘制取直径6mm的菌饼，备用。 6.2黄曲霉分生孢子悬浮液配制 将6.1中接种黄曲霉的平板，在30℃、相对湿度90%、黑暗中培养7d,用5mL吐温水溶液洗脱分 生孢子，用血球计数板在生物显微镜下计数，调整孢子浓度为1×108个/mL和1×106个/mL，备用。 6.3大肠杆菌菌悬液配制 生物安全柜中接种大肠杆菌于LB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养24h后，10倍系列梯 度稀释，按GB4789.3中规定的大肠菌群平板计数法计算菌体浓度，调整菌体浓度为1X101°CFU/mL 和1×10°CFU/mL，备用。 6.4生防菌株培养及菌悬液配制 6.4.1生防菌株培养 按GB4789.28的规定选择适宜的培养基和培养条件进行真菌类（霉菌和酵母菌）、细菌类、放线菌 类生防菌株培养。 6.4.2生防菌悬液配制 6.4.2.1真菌类生防菌 霉菌类生防菌产孢培养后，进行分生孢子洗脱，洗脱方法同6.2。按GB4789.15的规定对霉菌分 生孢子及6.4.1中培养的酵母进行计数，配制霉菌分生孢子及酵母菌悬浮液，浓度为1X101°CFU/mL 和1×10°CFU/mL，备用。 6.4.2.2细菌类生防菌 配制细菌类生防菌菌悬液，浓度为1X1010CFU/mL和1×10°CFU/mL，配制方法同6.3，备用。 6.4.2.3放线菌类生防菌 生物安全柜中接种放线菌于高氏1号平板培养基上，30℃培养7d,用吐温水溶液刮洗孢子和菌丝 无菌滤纸片过滤，获得孢子悬浮液，调整孢子浓度为1X101°CFU/mL和1X108CFU/mL，配制方法同 2 NY/T 3293—2018 6.4.2.1,备用。 7黄曲霉生防菌株活性鉴定方法 7.1平板对峙培养 7.1.1接种 挑取黄曲霉菌饼倒置于平板PDA培养基中央,将四片直径6mm的无菌滤纸片分别对称放于距 PDA平板中心25mm处，滤纸片上分别滴加10μL1X108CFU/mL生防菌株菌悬液（处理组）;以在滤 纸片上滴加10μL无菌水为对照组,其他操作同处理组。 7.1.2 培养 于恒温恒湿培养箱中30℃、相对湿度90%、黑暗培养6d。 7.1.3测定菌落直径 分别用直尺以十字交叉法测量处理组与对照组中黄曲霉菌落直径。 7.1.4结果计算 按式(1)计算生防菌株对黄曲霉菌丝生长的抑制率。 D,-D2 Xi = 2 ×100 Di - 6 (1) 式中： Xi——黄曲霉菌丝生长抑制百分率,单位为百分率(%); Di——对照组黄曲霉菌落直径,单位为毫米(mm); Dz——处理组黄曲霉菌落直径,单位为毫米(mm)。 7.2液体共培养 7.2.1接种 分别取200μuL1×101°CFU/mL生防菌株菌悬液和1×108个/mL黄曲霉孢子悬浮液同时接种于 20mL沙氏液体培养基中(处理组);以接种无菌水和黄曲霉孢子悬浮液为对照组1;以接种大肠杆菌菌 悬液和黄曲霉孢子悬浮液为对照组2,其他操作同处理组。 7.2.2培养 于恒温摇床中30℃、200r/min黑暗振荡培养6h、18h和4d。 7.2.3统计黄曲霉分生孢子萌发数 分别在振荡培养6h和18h后，每个处理显微镜下随机观察并统计200个黄曲霉孢子的萌发情况。 7.2.4测定黄曲霉菌丝干重 振荡培养4d后，用无菌滤纸片过滤培养液，过滤后的菌丝于烘箱中55℃烘干24h，电子天平称量 菌丝干重。 7.2.5测定黄曲霉毒素浓度 取2mL7.2.4中过滤后的滤液，按GB5009.22的规定测定黄曲霉毒素浓度。 7.2.6 结果计算 按式(2)计算细菌和酵母类生防菌株对黄曲霉孢子萌发的抑制率。 (2) Gi 式中: 黄曲霉孢子萌发抑制百分率,单位为百分率（%)； Gi 对照组黄曲霉孢子萌发数； G2— 处理组黄曲霉孢子萌发数。 NY/T 3293—2018 按式(3)计算细菌和酵母类生防菌株对黄曲霉菌丝生物量的抑制率。 X3 = (3) Wi 式中： 黄曲霉菌丝生物量抑制百分率,单位为百分率（%)； Wi——对照组黄曲霉菌丝干重,单位为毫克(mg); 处理组黄曲霉菌丝干重,单位为毫克(mg)。 按式(4)计算生防菌株对黄曲霉产毒力的抑制率。 M -M2 （4） M 式中： X4- Mi- -对照组中黄曲霉毒素 B<黄曲霉毒 微克每升 μg M2 微克每升（ g 总量为责曲 黄曲霉毒素 黄曲霉毒素 G 黄曲霉毒素 毒素B 的浓度之和。 S SE 7.3花生接种 7.3.1表面灭菌 氯化汞溶液的 烧杯中浸泡 10 min后，用 与虫斑的饱满花生籽粒，置 RC 无菌水漂洗两次 保持籽粒种皮完 7.3.2接种 分别取 灭菌的花生，在含有50mL黄曲霉孢子悬 10min( (对照组);在含有 粒 50mL无菌水的 尧杯中 液和黄 陷组 在含 重曲 霉孢子悬浮液 中浸泡 混合液的烧杯中 王防菌株菌 液的烧杯 10 hin后，再在含 黄曲霉孢 有 50mL黄曲霉 子悬浮液浓度均为 1X×106个/mL，生防 U/mL. 7.3.3培养 R 用无菌镊子轻轻耳 三中， 恒湿培养箱中30℃、 相对湿度 90%、12 h黑暗 12h 光照交替培 养7. 7.3.4鉴定黄曲霉侵染指数 按NY/T 2310的规定对 7.3.3中花生进 行黄田 分级和侵染 数计算。 7.3.5测定花生黄曲霉毒素含量 7.3.3中花生121℃高压灭菌30min 箱中110℃烘干1h,用高速粉碎机磨碎,称取5.00g花 生粉末，按GB5009.22的规定检测黄曲霉毒素 7.3.6 结果计算 按式(5)计算生防菌株对黄曲霉侵染的抑制率。 Xs = (5) Ri-R 式中： Xs 黄曲霉侵染抑制百分率,单位为百分率(%)； Ri- 对照组侵染指数； R2 -处理组侵染指数； 4 NY/T 3293—2018 R。—空白组侵染指数。 按式(6)计算生防菌株对黄曲霉产毒力的抑制率。 Pi-P。 ：(6) 式中: X。一—黄曲霉产毒力抑制百分率,单位为百分率(%); P1——对照组中黄曲霉毒素 B1、黄曲霉毒素 Bz、黄曲霉毒素 GI 和黄曲霉毒素 G2