ICS 65.100 B 17 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3288—2018 草对乙酰辅酶A羧化酶抑制剂类除草剂 靶标抗性检测技术规程 Guideline for the detection of Beckmannia syzigachne (Steud.) Fernald target-site resistance to acetolactate synthase inhibiting herbicides 2018-07-27 发布 2018-12-01实施 中华人民共和国农业农村部发布 NY/T 3288—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业农村部提出并归口。 本标准起草单位：中国农业科学院植物保护研究所。 本标准主要起草人：崔海兰、李香菊、黄兆峰、王京京、魏守辉、于惠林。 NY/T 3288—2018 菌草对乙酰辅酶A羧化酶抑制剂类除草剂 靶标抗性检测技术规程 1范围 本标准规定了蘭草[Beckmannia syzigachne（Steud.）Fernald]对乙酰辅酶A羧化酶（acetyl-coen- zyme A carboxylase,ACCase)抑制剂类除草剂靶标抗性检测技术规程的检测程序、结果分析及注意事项。 本标准适用于蘭草对乙酰辅酶 A羧化酶抑制剂类 生靶标抗性的有关检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本方 注日期白 日期的版本适用于本文 （包括所有的修改单）适 NY/T1667 农药 登记誉理 术语 NY/T1859 农药抗 风险评估 部 抗性风险评估 S SEARC! 3术语和定义 L NY/T 1667 3. 1 靶标抗性 rget-site sistance 由于除草 剂作 用靶标 巴标基因达 过量表达。 3. 2 CENT 非靶标抗性 杂草对除草剂白 吸收 化而导致的抗药 3. 3 整株生物测定法 通过整株杂草生 剂量梯度的反应,建 量的关系，以杂草 地上部生物量受除草剂的抑制程度 价其对除草剂敏感性的方法 3. 4 生长抑制中量 herbicide rate required for 50% growthreduction(GI 使杂草生物量降低50%的除草剂剂量。 3. 5 抗性指数 resistance index(RI) 除草剂对杂草疑似抗药性种群与敏感种群的生长抑制中量的比值。 3. 6 靶标基因突变 target-sitegenemutation 由于靶标基因DNA分子中碱基对的取代,导致mRNA的某一密码子发生变化，从而引起编码的 氨基酸变成另一种氨基酸,最终导致靶标酶多肽链中的氨基酸序列发生改变。 4检测程序 4.1种子采集 1 NY/T 3288—2018 当商草种子成熟时，在疑似发生抗药性的田块采集种子。采样田块应具有代表性，面积不小于667 m²，成熟种子量不少于2000粒。 及时晾干采集的种子，装入种子保存罐，置于阴凉干燥处保存。 4.2材料培养 选择无蘭草种子、无除草剂残留的农田地表土，混合20%～30%的草炭土，混合均匀后装人直径不小 于10cm的培养钵;待测种群及敏感对照种子经过0.05%～0.1%的赤霉素溶液浸泡12h～24h,冲洗干 净，分别定量均匀撒播在土壤表面,覆土0.2cm～0.5cm,采用盆钵底部渗灌方式补充水分；置于15℃～ 25℃,光照时间8h～10h条件下培养。待菌草长至2叶期，间苗，每盆保留长势一致的10个植株。 4.3生物测定 4.3.1单剂量甄别法 待植株长至3叶期,用待测除草剂(ACCase抑制剂类除草剂)进行茎叶喷雾处理，除草剂剂量采用 敏感种群的最低致死剂量，每个处理不少于4次重复,每个重复30株。用药21d后，调查存活株数，按 式(1)计算株防效(%)。 E = NL NT X 100 (1) 式中： E一—存活植株数占总处理植株数的百分比，单位为百分率(%); NL一一处理后存活植株数,单位为株; NT——处理植株总数,单位为株。 4.3.2剂量反应曲线法 经单剂量甄别法检测而明确有抗性的植株，进行繁殖，获得的种子用剂量反应曲线法进一步检测抗 药性指数。 待植株长至3叶期,用待测除草剂(ACCase 抑制剂类除草剂)进行茎叶喷雾处理,药剂处理至少设 置5个剂量，每个剂量不少于4次重复，每个重复10株。以杂草鲜重或干重为指标，建立剂量反应方 程，按式(2)计算生长抑制中量。 D-C (2) 式中： Y 在除草剂处理下杂草地上部分鲜重或干重与对照鲜重或干重的百分比,单位为百分率(%）； c 待测指标下限，单位为百分率（%）； D 待测指标上限，单位为百分率（%)； X 除草剂剂量，单位为克每公顷（g/hm²）； GR50 — 生长抑制中量，单位为克每公（g/hm）； b 斜率。 按式(3)计算抗药性指数RI。 GRsoR RI = GR50s (3) 式中： RI 抗药性指数； GR50R— 抗药性种群生长抑制中量，单位为克每公顷（g/hm²）； GR50s 敏感性种群生长抑制中量，单位为克每公顷（g/hm²）。 4.4靶标基因检测 4.4.1DNA提取 2 NY/T 3288—2018 取杂草幼嫩叶片，约200mg，采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB)法或商品化试剂盒提取总DNA。 每个抗药性种群随机检测10个～20个抗药性植株。 用1%琼脂糖凝胶电泳检测提取的DNA质量是否合格，电泳出现一条清晰明亮的条带，表示DNA 较完整，无降解。 DNA样品的纯度及浓度检测：用分光光度计测定DNA溶液在260nm处的吸光值（OD260）。OD260 值等于1时,样品中DNA浓度为50μg/mL。按式(4)计算DNA浓度。 CDNA = OD260 X A X 50 (4) 式中： CpNA ——DNA 浓度,单位为微克每毫升（μg/mL); OD260——DNA溶液在260nm处的吸光值； A——稀释倍数。 通过测定DNA溶液在260nm和280nm处的吸光值（OD260和ODz80）检测DNA纯度，OD260 OD280值在1.7～2.0之间,表明DNA的纯度较好。 经过电泳和吸光度检测，质量和纯度符合要求的DNA样品可用于后续检测。 4. 4. 2聚合酶链式反应(PCR) 用1对特异性引物扩增菌草ACCase，上下游引物序列分别为：5'-AAACTCTGGTGCTCGGAT TG-3'和 5'-TAGGCTTCCA TTTGCTCCC-3',扩增片段大小为 1308 bp。 PCR反应体系如下:2.5mmol/L的dNTP混合液2μL,10XPCRBuffer2.5μL,10μmol/L的引 物各0.5μL,5U/μL的TaqDNA聚合酶0.5μL,提取的待测DNA样品1μL,加18μL无菌蒸馏水 至反应体系为25μL。PCR反应条件如下：95℃加热5min，使DNA裂解变性；进入反应循环，在每一个 循环中,95℃裂解30s,58℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸5min，使产物延伸 完整。 PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测,判断产物片段大小与预期是否相符，根据条带亮度和有 无杂带,判断产物浓度和扩增特异性。 4.4.3PCR产物测序 PCR产物的电泳检测结果符合预期时，采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对产物进行回收纯化，纯 化后的PCR产物送测序公司测序，测序引物分别为上述引物对。 5结果分析 5.1单剂量甄别结果分析 喷施最低致死剂量的除草剂21d后调查株防效，敏感对照全部死亡，说明检测结果有效。如果待 测种群有存活植株，说明产生抗性，通过调查株防效可以初步了解该采样点是否产生抗性及抗性比例。 5.2剂量反应曲线结果分析 根据RI值判断抗药性水平高低。 5.3靶标基因检测结果分析 测序峰图序列与大穗看麦娘（AlopecurusmyosuroidesHuds.）（GenBank上的登记号为AJ310767） 和菌草(GenBank上的登记号为KF501577)的ACCase序列进行比对,分析靶标基因突变的位点。 目前在抗ACCase抑制剂类除草剂的杂草中发现有7个位点氨基酸被取代与抗性相关，分别是 1781位异亮氨酸被亮氨酸/缬氨酸/苏氨酸取代；1999位色氨酸被半胱氨酸/亮氨酸/丝氨酸取代；2027 位色氨酸被半胱氨酸取代；2041位异亮氨酸被天冬酰胺/缬氨酸取代；2078位天冬氨酸被甘氨酸取代 2088位半胱氨酸被精氨酸取代;2096位甘氨酸被丙氨酸/丝氨酸取代（氨基酸序列以大穗看麦娘为参 照)。靶标基因序列的测序峰图中上述位点发生相应的突变，即判断为有靶标抗性。 3 NY/T 3288—2018 5.4抗药性判断 如果检测结果中5.1、5.2和5.3均满足条件，即判断为靶标抗性；如果5.1和5.2检测结果为有抗 性,5.3检测结果为没有发生突变的情况，,判断可能是非靶标抗性。 6注意事项 6.1剂量反应曲线法中除草剂剂量的设置，应根据预实验来确定，敏感和抗药性种群的剂量可以不完 全一致。 6.2 PCR 反应体系和反应条件,因所使用试剂和仪器的不同而有所差异,需要前期预备试验摸索适合 各自实验室的最佳条件 6.3测序峰图中,在7个抗药性相关突变位点上出现套峰,判断为杂合突变。 6.4随着抗药性机理研究的深人 NY/T 3288—2018 中华人民共和国 农业行业标准 菌草对乙酰辅酶A羧化酶抑制剂类除草剂 靶标抗性检测技术规程 NY/T 3288—2018 * * 中国农业出版社出版 （北京市朝阳区麦子店街18号楼） （邮政编码：10012