ICS 65.100 B 17 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3280.2—2018 病毒微生物农药 棉铃虫核型多角体病毒 第2部分：棉铃虫核型多角体病毒水分散粒剂 Virus-basedinsecticides—Helicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus(HearNPV)- Part 2 : Helicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus water dispersible granule(WG) 2018-07-27 发布 2018-12-01实施 中华人民共和国农业农村部发布 NY/T 3280.2—2018 前言 NY/T3280《病毒微生物农药棉铃虫核型多角体病毒》分为3个部分： 第1部分：棉铃虫核型多角体病毒母药； 一 第2部分：棉铃虫核型多角体病毒水分散粒剂； 一第3部分：棉铃虫核型多角体病毒悬浮剂。 本部分为NY/T3280的第2部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本部分由农业农村部种植业管理司提出并归口。 本部分起草单位：农业农村部农药检定所、武汉中科威睿农业科技有限公司、中国科学院武汉病毒 研究所。 本部分主要起草人：肖凤平、王晓军、孙修炼、郭明程、类承凤、张忠信、张楠， I NY/T 3280.2—2018 病毒微生物农药棉铃虫核型多角体病毒 第2部分：棉铃虫核型多角体病毒水分散粒剂 1范围 本部分规定了棉铃虫核型多角体病毒水分散粒剂的要求、试验方法、产品的检验与验收以及标志、 标签、包装、储运、安全和保质期。 本部分适用于以病毒包涵体为主要成分的棉铃虫核型多角体病毒母药添加适宜的助剂和填料后加 P 2规范性引用文件 下列文件对于本文 期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的 用 包括所有的修改单)适 本 GB/T 1601 农药 pH 值的测 则定方法 GB/T 1604 商品 农药验收规则 GB/T 1605 商品 品农药采 方法 GB 3796 GB/T 4789. 食品卫生 主微生物学检验菌落总 GB/T 5451 GB/T 6682 析实验 GB/T 8170 数 值修约 GB/T14825 药悬浮 GB/T16150- GB/T 20813 产品 GB/T 28137 农药# 以起 GB/T32775 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本 3. 1 棉铃虫核型多角体病毒水分散粒剂 Helicoverpaarmigera nucleopolyhedrovirus(HearNPV) water dispersible granule( WG) 以棉铃虫核型多角体病毒包涵体与适宜的载体及分散剂经合适的工艺制作的可以在水中分散的粒剂。 3. 2 病毒包涵体polyhedral inclusion body(PIB) 病毒水平传播的主要载体形式,其结构特征是病毒粒子包埋于蛋白质基质的多角体中。 3. 3 生测效价比 potency ratio 根据药物的药理和对生物体的作用设计试验，比较样品、标准品引起的生物反应，测定药物效价或 其生物学活性。 NY/T 3280. 2—2018 3. 4 菌落形成单位colony forming units(CFU) 由单个菌体或聚集成团的多个菌体在固体培养基上生长繁殖所形成的集落。指在琼脂平板上经过 一定温度和时间培养后形成的每一个菌落，是计算细菌或霉菌数目的单位。 3.5 杂菌菌落总数 number of microbial contaminants 将棉铃虫核型多角体病毒水分散粒剂样品稀释后涂布在琼脂营养培养基上，所得到的微生物(真菌 和细菌)菌落数之和。 4要求 4.1外观 应为干燥的、能自由流动的灰褐色颗粒状,无可见机械杂质。 4.2规范项目及指标 棉铃虫核型多角体病毒水分散粒剂还应符合表1的要求。 表1棉铃虫核型多角体病毒水分散粒剂控制项目指标 项目 指标 病毒包涵体数量,PIB/g 标示值 生测效价比（标准品LCso/待测样品LCso），% ≥80 杂菌菌落总数,CFU/g ≤1.0X10 干燥减量，% ≤5. 0 细度(通过75μm试验筛),% ≥95. 0 pH 5.0~7.5 悬浮率(病毒包涵体)，% ≥75.0 粒径(0. 25 mm~1. 0 mm),% ≥90.0 分散性，% ≥75. 0 润湿时间，S ≤120 持久起泡量(1min),mL ≤25. 0 5试验方法 5.1一般规定 除非另有说明,本标准所用试剂均为分析纯,所述溶液均为水溶液,试验用水为GB/T6682中规定 的三级水。数值修约规则与极限数值的表示和判定符合GB/T8170的规定。 5.2抽样 按GB/T1605中“固体制剂采样”方法进行。用随机数表法确定抽样的包装件，最终抽样量应不少 于 200 g。 5.3病毒毒种的鉴定 通过提取试样中病毒 DNA作为模板,用 HearNPVme53基因和dbp 基因的特异性引物进行 PCR 扩增反应,琼脂糖凝胶电泳检测。当PCR扩增片段大小约为0.5kb时，回收扩增片段，并克隆到T载 体上,用M13通用引物对克隆后的PCR产物进行测序,将测序结果分别与棉铃虫核型多角体病毒(G4 株)的me53基因和dbp 基因序列进行比对分析,试样与 HearNPV(G4株)的me53 基因及dbp 基因的 -致性均应大于98%,即认定试样中的病毒为棉铃虫核型多角体病毒。 棉铃虫核型多角体病毒有效成分描述参见附录A。棉铃虫核型多角体病毒毒种的鉴定方法按照附 录B的规定。 2 NY/T 3280.2—2018 5.4病毒包涵体含量的测定 5.4.1方法提要 称取少量的病毒试样,用定量的水稀释成水悬浮液,并稀释至适当倍数后,滴加在血球计数板上,在 光学显微镜下计数。根据血球计数板上病毒包涵体的数量以及稀释倍数，计算出单位质量(体积)病毒 的数量。 5.4.2仪器、设备 分析天平：精确至0.0001g。 微量移液器：0.1mL~1mL。 容量瓶：10mL。 光学显微镜。 血球计数板及专用盖玻片 5.4.3测定步骤 RD 5. 4. 3. 1 准确称取一定量的试样(精确至 0 0001 g): oml 容 稀释成适当浓度的悬浮液(最终稀释液使每 各有2 球计数板的计数室上加盖专用盖玻片用微 量移液器吸取稀释后的 毒悬 盖玻片边缘，让悬液 自行缓缓渗人，一次性充满计数室，防止产生 人悬液的量以不超过计 与盖玻片之间的 矩形边缘为宜。多余悬液可用滤纸吸去 S 5.4.3.2将载有 有试样溶液的计 -数板静置 min，放在显微镜下观察，个计数池 电选取4角 及正中央5个中方格病毒包涵体的总数 计数池各 个中方格之和取其平均 计数结果。 5.4.4计算 R 试样中棉铃虫核型多角 式（1）计算 4 X 10 .....(1) 式中： X1 试样中 立为PIB 克（PIF 数他各 A 平均值，单 B 样品稀 堂升 每克(mL/g); 4X106 -1毫升母 数，单位为个每毫升（个/mL） 夜含有 小方 80 计数小方格数,单位 5.4.5允许差 病毒包涵体含量2次平行测定结果之差，应不大于20% 为测定结果。 5.5生测效价比的测定 生测效价比(标准品LCso/待测样品 LCs。）)的测定方法,按照附录C 的规定执行 5.6杂菌菌落数量的测定 按GB/T4789.2的规定执行。 5.7干燥减量的测定 5.7.1仪器、设备 分析天平：精确至0.001g。 扁形称量瓶：直径40mm。 电热干燥箱：控温范围(50℃～200℃)，误差士2℃。 干燥器。 5.7.2试验步骤 3 NY/T 3280.2—2018 将称量瓶在(105士2)℃电热恒温干燥箱内烘至恒重（精确至0.001g）。称取试样10.0g（精确至 0.001g），置于预先恒重的称量瓶中，将此瓶放入（105士2)℃的电热恒温干燥箱内干燥，1h后取出，在 干燥器中冷却至室温,称重。 5.7.3测定结果 干燥减量X²按式(2)计算。 (2) m 式中: X2 - 干燥减量，单位为百分率（%)； 试样的质量，单位为克(g)； m1 干燥后试样的质量，单位为克（g）。 5.8细度的测定 按GB/T16150一1995中湿筛法"的规定执行。 5.9pH的测定 按GB/T1601的规定执行。 5.10悬浮率的测定 称取1.00g试样（精确至0.0001g），按GB/T14825的规定进行悬浮率测定。 5.11粒度范围的测定 5.11.1仪器 标准筛组：0.25mm标准筛和1.0mm标准筛各1个。 振筛机：振幅36mm，263次/min。 天平：精度为0.1g。 5. 11.2 测定步骤 将标准筛上下叠装，大粒径筛置于小粒径筛上面，筛下装承接盘，同时将组装好的筛组固定在振筛 机上，准确称取100g(精确至0.1g)样品，置于上面筛中，加盖密封，启动振筛机振荡10min，收集小粒 径筛上物称量。 5.11.3 计算 试样的粒度X3按(3)式计算。 X3 = :(3) m 式中： X3 试样的粒度,单位为百分率（%）； m 试样质量，单位为克(g)； mi 小粒径筛上试样质量，单位为克（g）。 5.11.4允许误差 2次平行测定结果之差,应不大于0.5%,取其算术平均值作为测定结果。 5.12分散性试验 按GB/T32775的规定执行。 5.13润湿时间 按GB/T5451的规定执行。 5.14持久起泡量的测定 按GB/T28137的规定执行。 4 NY/T 3280.2—2018 b 产品的检验与验收 应符合GB/T1604的规定。极限数值处