ICS 65.100 B 92 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 2873—2015 农药内分泌干扰作用评价方法 Evaluation method of pesticide endocrine disrupting effects 2015-12-29 发布 2016-04-01实施 中华人民共和国农业部 发布 NY/T 2873—2015 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由农业部种植业管理司提出并归口。 本标准起草单位：农业部农药检定所、国家食品安全风险评估中心。 本标准主要起草人：陶传江、李宁、宋雁、陶岭梅、张丽英、李敏、刘然、孟宇晰、闫艺舟、张文众、谭彦 君、刘兆平、贾旭东、毛伟峰、方瑾、叶纪明。 I NY/T2873—2015 农药内分泌干扰作用评价方法 1范围 本标准规定了内分泌干扰作用的基本试验方法和技术要求。 本标准适用于评价农药的内分泌干扰作用 2规范性引用文件 仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件， 其最新版 月于本文件。 GB 5749 活饮 GB 14922 GB 1492 实验动物 微生 物学等级与监测 GB 149 实验动物 哺乳类实验动物 的遗传质量挂制 GB 14 验 动物配合饲料通用 质量标准 GB 1 492 实 动物配合饲料卫生标准 GB 492 JRA 验动物配合饲料营养成分 GB 动物 竟及设施 3术语和定 下列术 3. 1 农药 ticids 用于预防 灭或者控制 林业的病、虫 草和其他有 的地调节植物、昆虫 生长的化学合成或省来 天然物质 一种物质或者几种物 质的混 合物及其制剂。 3. 2 受试物 test substanee 被测试的单 3. 3 内分泌干扰物 endocrine disrupter 可改变生物或其后代、或（亚）群体内分泌系统功能进而引起不良健康效应的外源性物质。 4试验目的和程序 本方法用于检测和评价农药是否具有内分泌干扰作用，包括一阶段体外和体内试验、二阶段体内验 证试验。一阶段体外试验包括雌激素受体转录激活试验(用于筛选类雌激素活性物质)和体外类固醇合 成试验（用于筛查干扰类固醇合成的物质等）。一阶段体内试验包括子宫增重试验(用于筛选类雌激素 或抗雌激素活性作用的物质)、Hershberger试验（用于筛选类雄激素或抗雄激素效应以及抗甲状腺激 素作用物质）、青春期雌性大鼠试验（可用于筛选类雌激素、抗雌激素或抗甲状腺激素作用的物质）和青 春期雄性大鼠试验（可用于筛选类雄激素、抗雄激素或抗甲状腺激素作用的物质）。对于适合一阶段体 外方法的受试物，首先经过一阶段体外试验筛选后进人一阶段体内试验，不适合进行一阶段体外筛选的 受试物则直接采用一阶段体内试验进行筛选。如一阶段体内试验筛选显示阳性结果，则需对受试物进 NY/T 2873—2015 一步开展二阶段体内验证试验。二阶段体内验证试验是通过一代生殖毒性扩展试验，验证具有（抗)雌 激素、（抗)雄激素和抗甲状腺激素的物质，明确受试物对内分泌系统的潜在危害及靶点 5试验方法 5.1一阶段体外试验 5.1.1雌激素受体转录激活试验 5.1.1.1原理 本试验是利用报告基因技术，以细胞为模型来检测雌激素受体和配体的结合能力。受体与配体结 合后，受体一配体螯合物转移至细胞核，与特定的DNA响应元件结合，并转录激活一个荧光素酶报告 基因，引起荧光素酶表达增加。荧光素是一种酶作用底物，在荧光素酶的作用下，可被转化为一种生物 荧光产物，利用光度计或酶标仪可对其进行定量测定。 5.1.1.2试验步骤 5.1.1.2.1细胞株 采用稳定转染人类雌激素α受体基因的hERα-Hela细胞株，试验正式开始前应对该细胞株的有 效性进行判定。 5.1.1.2.2细胞培养 采用无酚红的Eagle'sMinimumEssentialMedium(EMEM)，加人60mg/L的卡那霉素、10%胎牛 血清（胎牛血清经右旋糖苷包裹的木炭处理去除雌激素活性物质，dextran-coated-charcoal-treated fetal bovineserum,DCC-FBS)，将细胞置于细胞培养箱培养[5%CO2，（37土1)℃]。当细胞覆盖率达到 75%～90%时，可进行传代培养，一般在100mm细胞培养血中加10mL细胞液，每毫升细胞液中有 0.4X105～1X105个细胞。用10%FBS-EMEM(或加有DCC-FBS的EMEM)将细胞悬浮，然后将 其移人96孔细胞培养板中（即铺板），每孔加入100μL细胞悬浮（含1×104个细胞）。之后，将细胞放 人5%CO2培养箱中（37土1)℃培养3h，然后开始细胞染毒。试验所用塑料器血不能被雌激素活性物 质污染。 为了保持试验的完整性，试验所用细胞复苏后应至少经传代培养一次，传代次数不超过40代。 5.1.1.2.3质量控制要求 5.1.1.2.3.1试验体系灵敏度的验证 在试验开始前和试验过程中,应采用适当浓度的阳性和阴性参比物对试验体系的灵敏度进行验证。 阳性参比物包括具有不同强度雌激素效应的物质[17β-雌二醇（17β-estradiol,E2），CAS号50-28-2; 17α-雌二醇,CAS号57-91-0;17α-甲基睾酮,CAS号58-18-4];阴性参比物为肾上腺酮（CAS号 99-45-6）。浓度设定如表1所示。 表1试验体系灵敏度的验证中阳性和阴性参比物浓度 项目 17β-雌二醇 17α-雌二醇 17α-甲基睾酮 肾上腺酮 浓度1 10nmol/L 1 μmol/ L 10 μmol/ L 100 μmol/ L 浓度2 1 nmol/ L 100nmol/L 1 μmol/ L 10 μmol/ L 浓度3 100pmol/L 10nmol/L 100 nmol/ L 1 μmol/ L 浓度 4 10pmol/L 1 nmol/ L 10 nmol/ L 100 nmol/ L 浓度5 1 pmol/ L 100pmol/L 1 nmol/ L 10 nmol/ L 浓度6 0.1pmol/L 10 pmol/ L 100 pmol/ L 1 nmol/ L 浓度7 0.01pmol/L 1 pmol/ L 10 pmol/ L 100pmol/L 5.1.1.2.3.2溶媒和阳性对照 应将受试物溶解于适当的溶媒中，溶媒应能增加受试物的溶解度，且易与细胞培养液混合，水、乙醇 2 NY/T28/32015 (95%～100%)和二甲基亚砜(DMSO)是较合适的溶媒。如使用DMSO,使用量不应超过0.1%（V/ V);若使用其他溶媒,则应证明其最大使用量不会产生细胞毒性。 每个培养板中应至少检测3份溶媒对照和3份阳性对照（PC,1nmol/L的E2）。如阳性对照所用 溶媒与受试物所用的溶媒不同时，也应在每个培养板中检测至少3个阳性物的溶媒。 5. 1. 1. 2. 3. 3 叠加效果 每个培养板的阳性对照荧光素酶活性响应均值应为溶媒对照的4倍以上。阳性对照(1 nmol/ L E2)的PC1o叠加效果应大于同时测定的溶媒对照叠加效果(=1)的1十2SD。 5. 1. 1. 2. 4 受试物剂量 受试物溶于溶媒中,按1：10的倍比稀释。设定受试物的剂量范围应考虑其溶解度和可能的细胞 毒性。在正式试验前应进行预试验，从受试物最大容许浓度开始，逐级稀释（如1000μmol/L、100 umol/L、10 μmol/L等）。如培养的细胞出现沉淀或较明显的细胞毒性，应调整受试物浓度，以获得较 好的剂量一反应曲线。如受试物某一浓度减少20%以上的细胞数，则可认为该浓度的受试物具有较明 显的细胞毒性,在正式试验中应避免使用该浓度及以上浓度进行试验。 5.1.1.2.5细胞染毒 将细胞悬浮液加人至96孔细胞培养板的孔中，每孔100μL(约104个细胞）。将不同浓度的受试物 以及阳性和阴性对照加人至培养板的孔中，每孔50μL，每个浓度设3个平行孔。每孔最终体积为150 μL。将培养板置于5%COz培养箱中,在(37土1)℃下培养20 h～24 h。 应注意具有强挥发性的化合物可能使临近的溶媒对照孔产生假阳性结果，推荐使用细胞培养板密 封盖，避免各孔之间的影响。 5. 1. 1. 2. 6 荧光素酶的检测 根据所用荧光检测设备的灵敏度选择相应的荧光素酶检测试剂，对荧光素酶进行定量测定。 5.1.1.3数据分析 计算溶媒对照的均值；用每孔测定数值减去溶媒对照均值，得到标准化数值；将受试物每孔标准化 均值除以阳性对照标准化均值，得到每孔的相对转录活性；计算受试物每个浓度组的相对转录活性均 值,判断是否具有剂量一反应关系。 计算公式：相对转录活性=（受试物每孔测定值一溶媒对照均值)/（阳性对照均值一溶媒对照均值） 如受试物在2次或3次重复试验中,有2次及以上重复试验的转录活性大于或等于阳性对照的 10%,则提示受试物在该浓度具有雌激素受体转录激活活性；如受试物在2次或3次重复试验中，有2 次及以上重复试验的转录活性小于阳性对照的10%,则提示受试物在该浓度不具有雌激素受体转录激 活活性。 同时,要计算产生一定相对转录活性的受试物的浓度。将结果表示为达到50%阳性对照(PC5o）或 10%阳性对照(PC1o）的浓度。10%阳性浓度(PC1o)是指所引起的效应水平等同于同一细胞培养板中经 阳性对照物(1nmol/LE2)诱导的效应水平为10%的受试物浓度。50%阳性浓度(PCso）是指所引起的 效应水平等同于同一细胞培养板中经阳性对照物（1nmol/LE2)诱导的效应水平为50%