ICS 65.020.01 B 04 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 2859--2015 主要农作物品种真实性SSR 分子标记检测 普通小麦 Variety genuineness testing of main crops with SSR markers-- Wheat (Triticum aestivum L.) 2015-10-09 发布 2015-12-01实施 中华人民共和国农业部发布 NY/T2859—2015 目 次 前言 1 1 范围 规范性引用文件 3 术语和定义 4 缩略语 5 总则. 6 检测方案 7 仪器设备、试剂和溶液配制， 8 真实性检测程序 9结果计算与表示 10结果报告 10 附录A（规范性附录） 溶液配制 1 附录B(资料性附录） 引物分组信息 附录C(规范性附录) 等位变异扩增片段信息 附录D(资料性附录） 参照样品名单…· I NY/T 2859—2015 前言 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。 请注意本标准的某些内容有可能涉及专利。本标准的发布机构不应承担识别这些专利的责任。 本标准由农业部种子管理局提出。 本标准由全国农作物种子标准化技术委员会（SAC/TC37)归口。 本标准起草单位：北京市农林科学院北京杂交小麦工程技术研究中心、全国农业技术推广服务中 心、北京市种子管理站。 本标准主要起草人：赵昌平、支巨振、邱军、庞斌双、刘丽华、王立新、谷铁城、刘丰泽、吴明生、刘阳 娜、张立平、张风廷、李宏博、赵海艳。 NY/T 2859—2015 主要农作物品种真实性SSR分子标记检测普通小麦 1 范围 本标准规定了利用SSR分子标记法进行普通小麦（TriticumaestiuumL.）常规品种真实性检测的 原则、检测方案、检测程序和结果报告。 本标准适用于普通小麦常规品种真实性验证和品种真实性身份鉴定，不适用于实质性派生品种 (EDV)和转基因品种的鉴定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T3543.1农作物种子检验规程总则 GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样 GB/T3543.5农作物种子检验规程真实性和品种纯度鉴定 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3. 1 品种真实性验证 variety verification 与其对应品种名称的标准样品比较，检测证实供检样品品种名称与标注是否相符。 3. 2 品种真实性身份鉴定varietyidentification 经SSR分子标记检测并通过审定品种SSR指纹数据比对平台（见3.4)筛查比较，确定供检样品的 真实品种名称。 3. 3 标准样品standard sample 国家指定机构保存的经认定代表品种特征特性的实物种子样品。 3. 4 SSR指纹数据比对平台SSRfingerprintblastplatform 采用SSR标记的标准化方法对品种标准样品的等位变异进行检测，并运用计算机数据库技术和网 络信息技术所构建的审定品种分子数据信息的检索比对载体。 3.5 参照样品reference control sample 用于校准供检样品SSR等位变异已定义扩增产物片段大小的样品。 3. 6 引物primer 模板DNA的互补链。 1 NY/T 2859—2015 3. 7 组合引物panel 记引物。 3. 8 核心引物coreprimer 以最少数量的引物最大限度地区分普通小麦品种的一套引物。 3. 9 扩展引物extended primer 辅助真实性检测的一套引物。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 bp:basepair碱基对 CTAB：cetyltrimethylammoniumbromide十六烷基三甲基溴化铵 DNAdeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸 dNTPsdeoxy一ribonucleosidetriphosphates脱氧核苷三磷酸 PAGE：polyacrylamidegelelectrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳 PCR:polymerasechainreaction聚合酶链式反应 SDS：sodiumdodecyl sulfate十二烷基磺酸钠 SSR：simple sequence repeat简单序列重复 Taq酶：Taq-DNApolymerase耐热DNA聚合酶 5总则 普通小麦的不同品种，其基因组存在着能够世代稳定遗传的简单重复序列（SSR)的重复次数差异。 这种差异可以通过从抽取有代表性的供检样品中提取DNA，用SSR引物进行扩增和电泳，从而利用扩 增片段大小不同而加以区分品种。 依据SSR标记检测原理，采用固定数目的SSR引物，通过与标准样品比较或与SSR指纹数据比对 平台比对的方式，对品种真实性进行验证或身份鉴定。真实性验证依据规定数目引物的SSR位点差异 数目而判定，品种真实性身份鉴定依据被检SSR位点无差异原则进行筛查、鉴定。 6检测方案 6.1总则 对于真实性鉴定，引物、检测平台、样品状况不同，其检测结果的准确度、精确度可能有所不同。应 依据“适于检测目的”的原则，统筹考虑检测规模和检测能力，择定适宜的引物、检测平台、样品状况，制 订相应的检测方案。 在严格控制条件下，合成选择的引物，按照确定的检测平台对供检样品按DNA提取、PCR扩增、电 泳、数据分析的程序进行检测。 6.2检测平台 6.2.1电泳是检测的关键环节。对于品种真实性验证或身份鉴定，可选择采用变性PAGE垂直板电 泳或毛细管电泳，如需要利用SSR指纹数据比对平台，则需要利用参照样品确定供检样品的指纹后再 NY/T 2859—2015 进行真实性身份鉴定。 6.2.2对于供检样品量较大的，可将组织研磨仪、DNA自动提取、自动移液工作站、高通量PCR扩增 仪、多引物组合的毛细管电泳进行组合，以提高检测的综合效率。 6.2.3DNA提取、PCR扩增和电泳的技术条件要求，在适于检测目的和不影响检测质量的前提下，按 照检测平台的要求允许对本标准的规定做适宜的局部改进。 6.3引物 6.3.1经对我国审定小麦品种进行SSR标记测试后，本文件避选了42对SSR引物作为品种真实性验 证和身份鉴定的检测引物，具体见表1和表2,并据此构建了已知品种的SSR指纹数据比对平台。表1 为核心引物，编号为PM01～PM21，表2为扩展引物，编号为PM22～PM42，每组包含21对引物。 表1核心引物信息 引物名称 染色体 退火温度 编号 (位置） ℃ 引物序列（5-3"） F: TCATTGGTGTCATCCCTCGTGT PM01 cwm65 1A 65 R:GAATAATGCCTTGACCCTGGAC F:GCGAATTAGCATCTGCATCTGTTTGAG PM02 barc80 1BL 65 R:CGGTCAACCAACTACTGCACAAC PM03 F:CTCCTTGGAATCTCACCGAA cfd72 1DL 60 R : TCCTTGGGAATATGCCTCCT PM04 2AL F:GGATTGGAGTTAAGAGAGAACCG gwm294 55 R: GCAGAGTGATCAATGCCAGA F: TTGTACATTAAGTTCCCATTA PM05 gwm429 2BS 55 R: TTTAAGGACCTACATGACAC PM06 F:CTCCCTGTACGCCTAAGGC gwm261 2DS 55 R:CTCGCGCTACTAGCCATTG PM07 3AL F:CAATCATTTCCCCCTCCC gwm155 55 R: AATCATTGGAAATCCATATGCC F: ATGACCCTTCTGCCAAACAC PM08 gwm285 3BS 65 R:ATCGACCGGGATCTAGCC PM09 F: TGGTTTTCTCGAGCATTCAA gdm72 3DS 55 R:TGCAACGATGAAGACCAGAA F : CTGCCTTCTCCATGGTTTGT PM10 gwm610 4AS 65 R:AATGGCCAAAGGTTATGAAGG F:GGAGAGGATAGGCACAGGAC PM11 ksum62 4B 60 R:GAGAGCAGAGGGAGCTATGG F:TTCCCATAACGCCGATAGTA PM12 barc91 4DL 55 R:GCGTTTAATATTAGCTTCAAGATCAT 5AS F:AGGAAACAGAAATATCGCGG PM13 gwm304 55 R: AGGACTGTGGGGAATGAATG 5BL F:ACCACACAAACAAGGTAAGCG PM14 gwm67 60 R:CAACCCTCTTAATTTTGTTGGG PM15 5DL F:GGTTGTCAGGCAGGATATTTG cfd29 65 R: TATTGATAGATCAGGGCGCA F:AATTTCAAAAAGGAGAGAGA PM16 gwm459 6AS 55 R: AACATGTGTTTTTAGCTATC F:CGCTGAAAAGAAGTGCCGCATTATGA PM17 barc198 6BS 55 R: CGCTGCCTTTTCTGGATTGCTTGTCA F:GCAATTTCACACGCGACTTA PM18 cfd76 6DL 6