ICS 65.140 B 47 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 2837—2015 蜜蜂瓦螨鉴定方法 Identification of Varroa from honey bees 2015-10-09发布 2015-12-01实施 中华人民共和国农业部 发布 NY/T 2837—2015 前言 本标准按照GB/T1.1--2009给出的规则起草。 本标准参考了世界动物卫生组织（OIE)制定的《陆生动物诊断试验和疫苗标准手册》（2012版）。 本标准由农业部兽医局归口。 本标准起草单位：中国农业科学院蜜蜂研究所。 本标准主要起草人：周婷、王强、代平礼、吴艳艳、周玮、徐书法、王星、段俊明、黄智勇。 NY/T 2837—2015 蜜蜂瓦螨鉴定方法 1范围 本标准规定了蜜蜂主要体外寄生瓦螨鉴定方法。 本标准适用于蜜蜂瓦螨一狄斯瓦螨（Varroadestructor）、雅氏瓦螨（V.jacobsoni）、林氏瓦螨 (V.rindereri）和恩氏瓦螨（V.underwoodi）的鉴定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。 NY/T1954蜜蜂螨病病原检查技术规范 SN/T 1684瓦螨病诊断方法 3试剂、材料和仪器 见附录A。 4瓦螨的分离方法 4.1碎屑分离法 4.1.1随机分离法 将包有铁纱网的薄铁板置于蜂箱底部，通常1d～2d内产生的碎屑中可见少量的瓦螨。 4.1.2药物分离法 按照NY/T1954的规定执行。 4.2封盖子分离法 用刀割去封盖子脾的房盖，再将温水喷淋巢脾，下面放置双层网筛，抖出巢房内的大幼虫或蜂蛹，使 蜜蜂大幼虫和蜂蛹留在上层粗网筛上（孔径2.2mm），而瓦螨落在下层细网筛中（孔径1mm）。 4.3成年蜜蜂糖粉或面粉分离法 将蜜蜂抖落于大漏斗内，利用500mL或1000mL容量的广口瓶收集大漏斗内的蜜蜂，约占瓶容量 的1/3。取10g80目的细糖粉或面粉倒人装有蜜蜂的广口瓶中，瓶口用3mm孔径铁纱网封严；将广口 瓶横置放于平面上来回滚动3min，使糖粉或面粉均匀黏附至每只蜜蜂体上。将广口瓶瓶口朝下剧烈振 荡，使糖粉或面粉及瓦螨振落于光滑白纸上，再分离收集掉落的瓦螨。 5瓦螨的鉴定方法 5.1形态学鉴定 利用体视解剖镜观察并记录瓦螨的大小、形状、背板颜色、胸板、生殖腹板、肛板、腹侧板和后足板形 状，刚毛对数和足等的形态特征。 5.2分子生物学鉴定 5.2.1样本采集 按照第4章的分离方法取得瓦螨，并将瓦螨浸于70%乙醇溶液中，一20℃保存。 1 NY/T 2837—2015 5.2.2总DNA简易提取法 单个瓦螨用无菌水洗涤，吸水纸吸干表面；将瓦螨置于1.5mL离心管内，加人40uL2×WLB缓冲 液（其中，蛋白酶K终浓度50ug/mL）后进行研磨，50℃孵育1h；100℃煮沸10min～15min，冷却至室 温，加人40uL超纯水，1000g离心5s备用。 5.2.3PCR扩增瓦螨mtDNA CO-I基因片段 5.2.3.1引物序列 上游引物:5'-GGAGGAGATCCAATTCTATATCAAC-3'; 下游引物:5'-CCTGTTATAATAGCAAATAC-3'; 预期扩增产物为458bp。 5.2.3.2PCR扩增体系 PCR扩增体系总体积为 50 μL: 总DNA提取液 10 μL 上、下游引物 各1μL Taq酶 0.5 μL 10Xbuffer 5 μL 10XdNTP(各 2.5mmol/ L) 1 μL 超纯水 31.5 μL 5.2.3.3PCR程序 94℃ 5 min 94℃ 60 s 50℃ 75 s ×30个循环 72℃ 90 s 72℃ 5 min 4℃ 5.2.3.4PCR扩增产物凝胶电泳检测 1.2%琼脂糖凝胶配制方法见附录A.1.3;5uL扩增产物加1μL上样缓冲液（6×DNALoading Buffer），DNAMarkerI(0.05mgDNA/mL)用量4μL。120V，30min；凝胶成像仪观察，并记录分析； 阳性PCR产物送测序公司进行序列测定。 5.2.4瓦螨mtDNACO-I基因限制性内切酶反应体系 5.2.4.1SacI限制性内切酶消化体系 Buffer I. 2 μuL Sac I 1 μL PCR产物 7 μL 超纯水 8 μL 37℃水浴2h，1.2%琼脂糖凝胶电泳分析酶切结果，电泳及凝胶成像方法参见5.2.3.4。 5.2.4.2XhoI限制性内切酶消化体系 Buffer H 2 μL Xho I 1μL PCR产物 7 μL 超纯水 8μL 37℃水浴2h，1.2%琼脂糖凝胶电泳分析酶切结果，电泳及凝胶成像方法参见5.2.3.4。 2 NY/T 2837—2015 6结果判定 6.1形态学鉴定 狄斯瓦螨形态学鉴定按照SN/T1684和NY/T1954（见图1）；雅氏瓦螨（体长平均1063.0um， 宽1506.8μm）与狄斯瓦螨（体长平均1167.3um，宽1708.9um)形态相似，但前者比后者的体型偏小， 而且更接近圆形（见图1和图2）；林氏瓦螨（体长平均1180μm，宽1698um）与狄斯瓦螨相似，胸板上的 刚毛和隙孔数目较少，气管长且弯曲度较大，须肢转节无刚毛，而其他3种瓦螨的相应部位均有一根刚 毛（见图1和图2）；恩氏瓦螨（体长平均746.6um，宽1167.6um）明显小于其他3种瓦螨，体形较狄斯 瓦螨横宽；腹面和背面构造与狄斯瓦螨十分相似，区别为背板两侧靠后缘各具15根～19根向外放射的 粗长刚毛（见图1和图2）。 a）狄斯瓦螨前面观 b）狄斯瓦螨腹面观 （周婷仿Vandame） （吴艳艳仿Angeleri） c）林氏瓦螨腹面观 d）雅氏瓦螨腹面观 (引l 自 Guzman and Delfinado-Baker) (弓l自GuzmanandDelfinado-Baker) e）恩氏瓦螨腹面观 （引自Delfinado-Baker） 图14种瓦螨雌螨形态示意图 NY/T 2837—2015 雅氏瓦螨背面观 b）雅氏瓦螨腹面观 狄斯瓦螨背面观 d）狄斯瓦螨腹面观 f）恩氏瓦螨背面观 e）林氏瓦螨背面观 500 μm 图24种瓦螨雌螨背面观或腹面观示意图 (引自 Anderson and Trueman) 6.2分子生物学鉴定 6.2.1瓦螨mtDNA CO-I基因酶切结果鉴定 在形态学初步判断出瓦螨类型。其中，分布在我国的狄斯瓦螨可根据酶切结果快速判定是否属于 附录B中所列的3种基因型（参见图B.1)。 6.2.2瓦螨mtDNA CO-I 基因核酸序列比对分析 PCR扩增产物若出现458bp特异性片段，将扩增产物进行测序，对此片段序列与已知瓦螨基因型 进行比较分析（参见表B.1)；若核酸序列与已知瓦螨基因型同源性为100%，可鉴定为相应瓦螨类型及 基因型；若与已知基因型有差异，则为瓦螨新基因型。 NY/T 2837-2015 附录A （规范性附录） 试剂、材料和仪器 A.1试剂 A.1.1蜂群中分离瓦螨的试剂 主要为氟胺氰菊酯条和双甲溶液（有效成分0.05%）。 A.1.22×寄生虫裂解缓冲液(WLB) 1 mol/L KCl 10 mL 1 mol/L Tris 2 mL 2 mol/ L MgCl2 0. 25 mL Tween 20 4.5 mL 20%NP-40（乙基苯基聚乙二醇) 4.5 mL 1%明胶 2 mL 超纯水 76.75 mL A.1.31.2%琼脂糖凝胶制备 琼脂糖1.2g与0.5×TBE电泳缓冲液混合至100ml，微波炉中完全融化。待冷至50℃～60℃ 时，加Goldenview溶液10μL，摇匀，倒入电泳槽内，待凝固后取下梳子备用。 A.2材料和仪器 A.2.1蜂群中分离蜂螨所用材料 主要为铁纱网（3mm、2.2mm和1mm孔径）、凡士林、放大镜、广口瓶（500mL或1000mL）、薄铁 板和过80目的砂糖粉或面粉。 A.2.2形态学和分子检测主要仪器 普通解显微镜、PCR扩增仪、核酸电泳仪和水平电泳槽、凝胶成像仪、高速冷冻离心机、微波炉和 恒温水浴锅。 5