ICS 67.180.10 B 47 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 2821—2015 蜂胶中咖啡酸苯乙酯的测定 液相色谱一串联质谱法 Determination of caffeic acid phenethyl ester in propolis- Liquid chromatography tandem mass spectrometry 2015-10-09发布 2015-12-01实施 中华人民共和国农业部发布 NY/T 2821—2015 前 言 本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草 本标准由农业部畜牧业司提出。 本标准由全国畜牧业标准化技术委员会（SAC/TC274)归口。 本标准起草单位：农业部农产品及转基因产品质量安全监督检验测试中心（杭州）、杭州蜂之语蜂业 股份有限公司。 本标准主要起草人：钱鸣蓉、王强、章虎、周萍、吴俐勤、王祥云、汪建妹、章征天。 I NY/T 2821—2015 蜂胶中咖啡酸苯乙酯的测定液相色谱一串联质谱法 1范围 本标准规定了蜂胶中咖啡酸苯乙酯的液相色谱一串联质谱测定方法。 本标准适用于蜂胶乙醇提取物及蜂胶胶囊中咖啡酸苯乙酯的测定。 本标准方法最低检出限为3mg/kg，定量限为10mg/kg， 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3原理 用甲醇溶解，超声波提取蜂胶中的咖啡酸苯乙酯，液相色谱一串联质谱仪测定，外标法定量。 4试剂和材料 除非另有说明，均使用分析纯试剂，水为GB/T6682规定的一级水。 4.1甲醇：色谱纯。 4.2稀释液：甲醇十水=80十20。 4.3咖啡酸苯乙酯标准物质：纯度≥97%。 4.4咖啡酸苯乙酯标准储备溶液：准确称取咖啡酸苯乙酯标准物质，用甲醇配制质量浓度为1000 mg/L的溶液，一18℃冰箱中保存，有效期为12个月。 4.5咖啡酸苯乙酯标准中间溶液：吸取适量咖啡酸苯乙酯标准储备溶液（4.4），用甲醇稀释配制质量浓 度为1mg/L的溶液，0℃～4℃保存，有效期为1个月。 mg/L、0.01mg/L、0.05mg/L、0.20mg/L和0.50mg/L多个质量浓度的标准工作溶液，绘制标准工 作曲线。 4.7滤膜：有机,0.22μm($25mm)。 4.8聚丙烯离心管：50mL。 5仪器 5.1液相色谱一串联质谱仪：配有电喷雾离子源。 5.2粉碎机。 5.3分析天平：感量0.0001g。 5.4超声波清洗器。 5.5高速离心机：转速不低于7000r/min。 6分析步骤 6.1试样的制备 1 NY/T 2821—2015 6.1.1蜂胶乙醇提取物的制备 从全部蜂胶样品中取出约100g样品，装入洁净容器中分成2份，密封，并做标记。将试样于 一10℃以下保存。样品测定前，取出冷冻贮存的试样20g～30g，迅速粉碎。 6.1.2蜂胶胶囊的制备 取装量差异项下胶囊内容物20g～30g，混匀。 6.2试样处理 准确称取0.2g（精确到0.1mg）蜂胶试样，置于150mL的具塞锥形瓶中，加人85mL甲醇，超声15 min，冷却至室温，转移至100mL棕色容量瓶中，用甲醇冲洗具塞锥形瓶并转移至容量瓶中，用甲醇定 容，混匀。吸取10mL溶液至50mL离心管中，以7000r/min的转速离心10min，吸取1mL上清液至 50mL棕色容量瓶中，用稀释液（4.2)定容，混匀后过滤膜待测。 6.3测定条件 6.3.1液相色谱参考条件 a） 色谱柱：Cl：（150mm×2.1mm，3um）或相当者 流动相：以含0.5%甲酸的甲醇为流动相A，以含0.5%甲酸的5mmol/L乙酸铵溶液为流动 相B,A与B之间的比例为8十2； 流速：0.2mL/min； d）进样量：5μL； e) 柱温：30℃。 6.3.2 质谱参考条件 a) 离子源：电喷雾离子源； b) 扫描方式：负离子扫描； 喷雾电压：3000V； d) 毛细管温度：350℃； e) 雾化气和气帘气为氮气，碰撞气为氩气； 检测方式：多反应监测（MRM），多反应监测条件见表1。 表1咖啡酸苯乙酯的保留时间和多反应监测条件 保留时间 定量离子对 定性离子对 碰撞能量 中文名称 min m/ 2 m/ 2 eV 咖啡酸苯乙酯 3. 5 283.1/135.0 283.1/135.0;283.1/179.0 29; 21 6.4定性测定 检出的色谱峰保留时间与咖啡酸苯乙酯标准物质保留时间相对标准偏差在土2.5%以内，并且在扣 除背景后所选择的两对离子对的丰度比偏差不超过表2的规定，则可判断样品中存在咖啡酸苯乙酯。 表2定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度 >50% 20%~50% 10%~20% ≤10% 允许的相对偏差 ±20% ±25% ±30% ±50% 6.5定量 本方法采用外标法定量，将标准工作溶液（4.6)分别进样，以标准工作溶液质量浓度为横坐标，以峰 面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。用标准工作曲线对样品进行定量，试液中分析物的响应值应在仪器 测定的线性范围内。如试样溶液中咖啡酸苯乙酯质量浓度值超出0.50mg/L，则用稀释液（4.2)稀释后 测定。在上述条件下，标准溶液和蜂胶样品中咖啡酸苯乙酯的液相色谱一质谱/质谱多反应监测 (MRM)色谱图参见附录A。 2 NY/T 2821-2015 7结果计算 试样中咖啡酸苯乙酯的含量以质量分数计，数值以@表示，单位为毫克每千克（mg/kg），按式（1） 计算。 mX1000 (1) 式中： V一一定容体积，单位为毫升（mL）； f-一定容后稀释的倍数； m一一试样质量，单位为克(g)。 注：计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。 8 精密度 NY/T 2821—2015 附录A (资料性附录） 多反应监测(MRM)色谱图 A.1咖啡酸苯乙酯标样多反应监测(MRM)色谱图 见图A.1。 RT:0.0-8.0 SM:9G RT:3.5 100 NL:1.47E4 90 m/z=134.50-135.50F:-c 80 ESI sid=10.00 SRM ms2 Relative Abundance OL 283.000[134.999-135.001, 60 178.999-179.001JMS ICIS 5-std-10ppb 50 40 30 m/z283.1/135.0 20 10 .01 100 ART:3.5 NL:1.28E4 06 m/z=178.50-179.50F:-c 801 ESI sid=10.00 SRM ms2 283.000[134.999-135.001, 70 178.999-179.001JMS ICIS 60 5-std-10ppb 501 m/z283.1/179.0 40 30 201 10 0 0 1 2 5 6 Time(min) 图A.1 质量浓度为0.01mg/L咖啡酸苯乙酯标样多反应监测(MRM)色谱图 A.2蜂胶样品中咖啡酸苯乙酯的多反应监测(MRM)色谱图 见图A.2。 NY/T 2821—2015 RT:0.0-8.0 SM:9G 100 RT;3.5 NL:6.87E3 106 m/z=134.50-135.50F:-c Relative Abundance 80 ESI sid=10.00 SRM ms2 70 283.000[134.999-135.001, 60 m/z283.1/135.0 178.999-179.001 JMS ICIS 501 12-sample 40 30 10 03 100 RT:3.5 106 NL:6.40E3 80 m/z=178.50-179.50F:-c OL ESI sid=10.00 SRM ms2 60 283.000[134.999135.001, 50 178.999-179.001JMS ICIS 40 n/z283.1/179.0 12-sample 20 10 0 2 3 4 5 6 Time(min) 图A.2 蜂胶样品中咖啡酸苯乙酯的多反应监测(MRM)色谱图 5