ICS 65.020 B 16 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 2811—2015 橡胶树棒孢霉落叶病病原菌分子检测技术 规范 Molecular detection for pathogen of Corynespora leaf fall disease of rubber tree 2015-10-09 发布 2015-12-01实施 中华人民共和国农业部 发布 NY/T 2811—2015 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由农业部农垦局提出。 本标准由农业部热带作物及制品标准化委员会归口。 本标准起草单位：中国热带农业科学院环境与植物保护研究所。 本标准主要起草人：谢艺贤、漆艳香、张欣、蒲金基、张贺、陆英、喻群芳、张辉强。 NY/T 2811—2015 橡胶树棒孢霉落叶病病原菌分子检测技术规范 1范围 本标准规定了橡胶树棒孢霉落叶病病原菌（Corynespora cassicola）的术语和定义、检测方法、结果 判定、样品保存等技术要求。 本标准适用于橡胶树的棒孢霉落叶病病原菌的检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3. 1 橡胶树棒跑囊落叶病：corynespora leaf fall disease of rubber tree 由多主孢酶［Corynespora cassicola（BerketCurt.）Wei］引起的种为害橡胶树叶片和嫩梢 的真菌病害。该病害病原菌的学名、形态特征及其危害症状参见附录A。 4检测方法 4.1原理 根据橡胶树棒孢霉落叶病病原菌核糖体基因内转录间隔区（rDNA-ITS）特有碱基序列设计特异 性引物进行PCR扰增。依据是否扩增获得预期272bp的DNA片段，判断样品中是否携带橡胶树棒孢 霉落叶病病原菌。 4.2仪器 显微镜（10×4α倍）、高压灭菌锅、高速冷冻离心机（最大离心力25000×g)、PCR扩增仪、电泳仪及 紫外凝胶成像仪等。 4.3试剂及配制方法 4. 3. 11 mol/ L Tris ~ HCI(pH 8. 0) 称取121.1g三羟甲基氨基甲烷（Tris.优级纯）溶解于800mL一级超纯水中，用盐酸（HCl，分析 纯）调pH至8.0，加超纯水定容至1000mL。分装后高温灭菌（121℃）20min，4℃或室温保存备用。 4. 3. 210 mol/ L NaOH 称取80.0g氢氧化钠（NaOH，分析纯)溶解于160mL一级超纯水中，溶解后再加一级超纯水定容 到 200 mL。 4. 3. 31 mol/L EDTA - Na2 (pH 8. 0) 称取372.2g乙二铵四乙酸二钠（EDTA-Na2，优级纯），溶解于70mL级超纯水中，再加人适量 NaOH溶液（4.3.2），加热至完全溶解后，冷却至室温，再用NaOH溶液（4.3.2）调pH至8.0，加超纯水 定容至100mL。分装后高温灭菌（121℃）20min，4℃或室温保存备用。 4.3.4CTAB提取液(pH8.0) NY/T 2811—2015 称取81.9g氯化钠（NaCl,分析纯）溶解于800mL一级超纯水中，缓慢加人20g十六烷基三甲基溴 化铵（CTAB，优级纯），加热并搅拌，充分溶解后加人100mLTris-HC1（4.3.1），4mLEDTA-Naz （4.3.3），加一级超纯水定容至1000mL，分装后高温灭菌（121℃）20min，室温保存，研磨植物材料之 前加β-巯基乙醇（分析纯）至体积分数为2%。 4.3.5CTAB沉淀液 称取2.34gNaCl（分析纯）溶解于800mL一级超纯水中，缓慢加人50gCTAB（优级纯），加热并搅 拌，充分溶解后加级超纯水定容至1000mL，分装后高温灭菌（121℃）20min，室温保存备用。 4. 3. 61. 2 mol/ L NaCl 称取70.2gNaCl(分析纯)溶解于800mL一级超纯水中，加一级超纯水定容至1000mL，分装后高 温灭菌（121℃）20min，4℃或室温保存备用。 4.3.7TE缓冲液(pH8.0) 分别量取10mLTris-HCl(4.3.1)和1mLEDTA-Na2（4.3.3），加一级超纯水定容至1000mL。 分装后高温灭菌（121℃）20min，4℃或室温保存备用。 4.3.8加样缓冲液 苯蓝（化学纯）溶解于10ml一级超纯水中；称取50.0g蔗糖（化学纯）溶解于30mL一级超纯水中。 混合以上3种溶液，加一级超纯水定容至100mL，4℃或室温保存备用 4.3.950×TAE电泳缓冲液(pH8.0) 称取242.2gTris（优级纯），先用500mL一级超纯水加热搅拌溶解后，加人100mLEDTA-Nas 用一级超纯水稀释成1XTAE。 4.3.10PCR反应试剂 10XPCR缓冲液（Mg2+Plus）、dNTP（2.5mmol/L）、Taq聚合酶（5U/μL）及特异性引I物对（20 μmol/ L)。 4.3.11其他试剂 Tris饱和酚（pH≥7.8）、氯仿、异戊醇、异丙醇、无水乙醇均为分析纯，核酸染料（高纯度）及DNA 分子量标准。 4.4PDA培养基 （化学纯）充分溶解后，加级超纯水定容至1000mL，分装后，每100mL培养基中加入2.2g琼胶（高 纯度），高温灭菌（121℃）20min，4℃或室温保存备用。 4.5操作步骤 4.5.1取样 仔细检查橡胶树叶片和嫩梢，采集橡胶树棒孢霉落叶病疑似症状（参见A.3)叶片或嫩梢带回实验 室，称取样本200g，装人牛皮纸袋中，备用。 4.5.2显微观察 从疑似病样病斑上挑取或用透明胶粘取霉状物制成临时玻片进行镜检，观察有无类似多主棒孢霉 的分生孢子梗及分生孢子（参见A.2）。 4.5.3PCR模板制备 植物材料准备：剪取待检材料病健交界处叶片或嫩枝组织1g，置于研钵中加液氮冷冻后充分研磨 成粉。 菌丝样品准备：将橡胶树棒孢霉落叶病病原菌菌株接种到PDA培养基上，28℃培养10d，用载玻 2 NY/T 2811-2015 钵中加液氮冷冻后充分研磨成粉。 总DNA提取：称取100mg干粉置于1.5mL离心管中，加人250μLCTAB抽提液充分混匀后，于 65℃水浴30min。离心（14000×g，10min）；取上清，加人等体积Tris饱和酚（pH7.8）：氯仿：异戊 醇（25：24：1的体积比），充分混匀，离心（14000×g，10min）；取上清，加人2倍体积CTAB沉淀液， 室温温育60min；离心（14000×g，10min），弃上清，用350uLNaCl(1.2mol/L）溶解沉淀，加人等体 积氯仿：异戊醇（24：1的体积比），混匀；离心（14000×g，10min），取上清于另一新离心管，加入0.6 倍体积异丙醇沉淀核酸；离心（14000×g，10min），弃上清，用体积分数为75%的乙醇悬浮沉淀，离心 （14000×g，10min），弃上清，重复该步骤一遍，晾干后将DNA溶解于100μLTE缓冲液或150μL超 纯水中，置于一20℃保存备用。采用DNA提取试剂盒的，操作步骤参照产品说明书。 无病橡胶树叶片基因组DNA按同样的方法制备与保存。 4.5.4PCR反应体系 在PCR薄壁管中分别加人以下试剂（25μL体系）后进行PCR反应：1uL总DNA（100ng），10× PCR缓冲液（Mg²+Plus)2.5uL，脱氧核糖核苷酸（dNTP)混合物2uL，特异性引物（见表1)各0.5μL， Taq酶0.2μL,无菌-级超纯水18.3μL。 表1PCR反应的引物及扩增产物 引物名称 引物序列 预期扩增产物 CCF 5'- CCC TTC GAG ATA GCA CCC- 3 272 bp CCR 15'- ATG CCC TAA GGA ATA CCA AA-3 反应条件：94℃预变性2min；后30个循环为94℃变性45s～60s;62℃退火45s～~60s；最后72℃ 延伸5min。取出PCR反应管，对反应产物进行电泳检测或于4℃条件下保存，存放时间不超过24h。 4.5.5PCR对照设置 4.5.5.1阳性对照 用橡胶树棒孢霉落叶病病原菌提取的总DNA作为模板。 4.5.5.2样品对照 用无病橡胶树叶片提取的总DNA作为模板。 4.5.5.3空白对照 用无菌一级超纯水作为模板。 4.5.6PCR产物凝胶电泳检测 4.5.6.1凝胶制备 用1×TAE工作液配制质量分数为1.0%琼脂糖凝胶，在微波炉中溶化混匀，冷却至60℃左右；加 人核酸染料，混匀，倒入胶槽，插上样品梳；待凝胶凝固后，拔出固定在凝胶中的样品梳，将带凝胶的胶板 置于电泳槽中，使样品孔位于电场负极，向电泳槽中加人1×TAE电泳缓冲液（缓冲液越过凝胶表面 即可）。 4.5.6.2加样与电泳 取1uL加样缓冲液与5uLPCR反应产物，混匀，然后分别将其和DNA分子量标准加入到电泳槽 的负极样品孔中；接通电源，电泳电压为5V/cm，当加样缓冲液中的溴酚蓝迁移到凝胶1/2位置，切断 电源，停止电泳。 4.5.7防污染措施 检测过程中防污染措施按照GB/T19495.2中的规定执行。 3 NY/T 2811—2015 5 结果判定 PCR检测结果判定见表2。 表 2 PCR检测结果判定表 判定条件 PCR产物在272 bp处是否有条带出现(见附录B)