ICS 67.080 B 31 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 2795—2015 苹果中主要酚类物质的测定 高效液相色谱法 Determination of major phenolic compounds in apple- High performance liquid chromatography 2015-05-21 发布 2015-08-01实施 中华人民共和国农业部发布 NY/T 2795—2015 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由农业部加工局提出并归口。 本标准起草单位：中国农业科学院农产品加工研究所、中国农业科学院果树研究所。 本标准主要起草人：刘璇、毕金峰、陈芹芹、吴昕烨、邓健康、聂继云、易建勇、周林燕、郑金铠、周沫、 李静。 1 NY/T 2795—2015 苹果中主要酚类物质的测定 高效液相色谱法 1范围 本标准规定了苹果中主要酚类物质的高效液相色谱测定方法。 本标准适用于苹果中没食子酸、原儿茶酸、新绿原酸、原花青素B1、儿茶素、绿原酸、原花青素B2、 咖啡酸、表儿茶素、P-香豆酸、芦丁、阿魏酸、皮苷、根皮苷、榭皮素和根皮素等单个或多个组分含量的 测定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3原理 苹果中的主要酚类物质经乙醇溶液提取，C18固相萃取柱净化、定容，微孔滤膜过滤，高效液相色谱 法测定，外标法定量。 4试剂和材料 除非另有说明，本标准所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的-一级水。 4.1试剂 4. 1.1 乙醇(CH:CH2OH,CAS号:64-7-5)。 4.1.2乙睛（CH:CN,CAS号：75-05-8)，色谱纯。 4.1.3甲醇(CH3OH,CAS号：67-56-1)，色谱纯。 4.1.4甲酸（HCOOH,CAS号：64-18-6)，色谱纯。 4.2试剂配制 4.2.2甲酸溶液（2%，体积分数）：取2mL甲酸（4.1.4），用水稀释至100mL。 4.2.3甲酸一乙腈溶液（95十5）：取95ml.甲酸溶液（4.2.2），加入5mL乙腈中，混匀。 4.3标准品 4.3.1没食子酸（C,H.O,），纯度≥98%。 4.3.2原儿茶酸（CHO），纯度≥99%。 4.3.3新绿原酸(Ci6H18Og），纯度≥98%。 4.3.4原花青素B1(C30H26O12），纯度≥95%。 4.3.5儿茶素（C1sH14O），纯度≥98%。 4.3.6绿原酸(ClsH1Og）,纯度≥95%。 4.3.7原花青素B2(C3oH26O12），纯度≥98%。 NY/T 2795-2015 4.3.8咖啡酸（CgH.O4），纯度≥95%。 4.3.9表儿茶素（C15H14O），纯度≥98%。 4.3.10P-香豆酸(CgHsO）,纯度≥98%。 4.3.11芦丁（C2H3O1），纯度≥98%。 4.3.12阿魏酸（CHlO4），纯度≥99%。 4.3.13皮苷（C2H20O11），纯度≥98%。 4.3.14根皮苷（C21H28O12），纯度≥98%。 4.3.15皮素（C5H14O），纯度≥98%。 4.3.16 5根皮素（C1sH14O），纯度≥99%。 4.4标准溶液配制 4.4.12mg/mL单-一酚类物质标准储备溶液：分别准确称取酚类物质标准品（4.3）10mg（精确到 0.0001g），于5mL棕色容量瓶中，用甲醇（4.1.3)溶解并稀释至刻度，配制成质量浓度为2mg/mL的 单一酚类物质标准储备溶液。一20℃以下避光贮存，有效期一个月。 4.4.20.1mg/mL酚类物质混合标准中间溶液：分别准确吸取0.1mL单一酚类物质标准储备溶液 （4.4.1）于2mL棕色容量瓶中，用甲醇（4.4)稀释至刻度，配置成质量浓度为0.1mg/mL酚类物质混合 标准中间溶液。一20℃以下避光贮存，有效期一周。 4.4.3酚类物质标准工作溶液：分别吸取酚类物质混合标准中间溶液（4.4.2）0.02ml、0.1mL、 0.2mL、0.4mL、1.0mL至2mL棕色容量瓶中，用甲酸-乙睛溶液（4.2.3）定容至刻度，配制成质量浓 度为1mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L和50mg/1.的系列混合标准工作溶液。现配现用。 4.5材料 4.5.1C18固相萃取柱。 4.5.2滤膜：0.45um，有机相。 5仪器 5.1液相色谱仪：配有紫外检测器或二极管阵列检测器。 5.2分析天平：感量0.0001g、感量0.01g。 5.3研磨仪。 5.4离心机：转速可达到10000r/min。 5.5漩涡混合器。 5.6旋转蒸发器。 5.7超声波萃取仪：工作频率40kHz，功率500W。 5.8固相萃取器。 5.9圆底烧瓶：100ml。 5.10聚四氟乙烯离心管：50mL。 6试样制备与保存 将苹果样品，用干净纱布轻轻将样品表面擦净，按取样要求取200g样品采用对角线分割法，取对 角部分，将其切碎，充分混均，再用四分法取样，用液氮冷冻后，于研磨仪中研磨成粉末，装人聚乙烯塑料 瓶，一20℃以下保存，备用。 2 NY/T 2795-—2015 7分析步骤 7.1提取 称取试样5g（精确到0.01g）于50mL聚四氟乙烯离心管中，加人20mL乙醇溶液（4.2.1），用漩涡 混合器充分混合，室温下超声提取15min，以10000r/min转速、4℃离心10min，上清液倒人50mL棕 色容量瓶中，重复提取1次，上清液合并转入50mL棕色容量瓶中，用乙醇溶液（4.2.1）定容至50mL， 备用。 7.2浓缩 准确吸取10ml.样品提取液（7.1）于100mL圆底烧瓶中，在旋转蒸发器上减压蒸发至除去乙醇， 温度≤40℃，待净化。 7.3净化 min。将待净化液（7.2)加人固相萃取柱中，用5mL水清洗旋转蒸发后的圆底烧瓶，加入固相萃取柱 中，用3mL水淋洗，弃去；再用5mL甲醇（4.1.3）分2次清洗圆底烧瓶，加入到固相萃取柱中，收集洗 脱液至10mL棕色容量瓶中并定容，过0.45um有机相微孔滤膜，供高效液相色谱测定。 7.4液相色谱参考条件 色谱柱：C：色谱柱，4.6mmX250mm，粒径5um，或相当者； 流动相：A为2%甲酸溶液，B为乙睛，用前过0.45um滤膜，脱气，梯度洗脱程序见表1。 表1流动相梯度洗脱程序（VA十VB） 间期 A B min 0 95 5 30 75 25 45 60 40 50 60 40 51 95 5 60 95 5 柱温：40℃； 流速：0.8mL/min; 检测波长:280nm,320nm,360nm; 进样量：10uL。 苹果中各主要酚类物质在其最佳定量波长下进行检测，各酚类物质的最佳定量波长见附录A。 7.5标准工作曲线 纵坐标，对应的标准溶液质量浓度（mg/L)为横坐标，绘制标准曲线。求回归方程和相关系数。 7.6测定 做3份试料的平行测定，取10uL试样溶液和相应的标准工作溶液在与标准相同的色谱条件下进 行测定，以色谱峰保留时间定性，以色谱峰峰面积定量。标准工作溶液的高效液相色谱图参见附录B。 同时做空白试验，除不称取试料外，均按7.1～7.3操作步骤进行测定， 8结果计算 苹果中被测酚类物质以质量分数计，单位以毫克每千克（mg/kg)表示，按式(1)计算。 3 NY/T 2795—2015 AXp, XV。XV? X= (1) A, XmXVi 式中： 试料中某一酚类物质的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）； Os -标准工作溶液中某一酚类物质组分的质量浓度，单位为毫克每升（mg/L）； A 试样溶液中某一酚类物质组分的峰面积； A,- -标准溶液中某一酚类物质组分的峰面积； Vo- 一试料中酚类物质提取液定容体积，单位为毫升（mL）； Vi—过Cis固相萃取柱所用酚类物质提取液体积，单位为毫升（mL）； V2——C18固相萃取柱净化后定容体积，单位为毫升（mL）； m 试料的质量，单位为克（g）； 计算结果保留三位有效数字。 9精密度 9.1重复性 在重复性条件下，获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的20%。 9.2再现性 在再现性条件下，获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的20%。 10其他 本标准的定量测定范围：没食子酸、原儿茶酸、新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、P-香豆酸、芦丁、阿魏酸、 皮苷、根皮苷和根皮素均为0.25mg/kg～100mg/kg； 儿茶素和皮素均为0.5mg/kg~100mg/kg； 原花青素B1、原花青素B2和表儿茶素均为1mg/kg～100mg/kg。 本标准方法的检出限：没食子酸、原儿茶酸、新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、P-香豆酸、芦丁、阿魏酸、 皮苷、根皮苷和根皮素为0.12mg/kg，儿茶素和皮素为0.25mg/kg，原花青素B1、原花青素B2和表 儿茶素为0.5mg/kg。 NY/T2795—2015 附录A (规范性附录) 苹果多酚定量波长 苹果多酚定量波长见表A.1。 表A.1苹果多酚定量波长 序号 中文名 CAS号 定量波长 nm 1 没食子酸 149-91-7 280 2 原儿茶酸 99-50~3 280 3 新绿原酸 906-33-2 320 4 原花青素B1 20315-25-7 280 5 儿茶素 154-23-4 280 6 绿原酸 327-97-9 320 7 原花青素B2 29106-4