ICS 65.100.01 G 23 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 2769--2015 牧草中15种生物碱的测定 液相色谱一串联质谱法 Determination of 15 alkaloids in forage- Liquid chromatography-tandem mass spectrometry 2015-05-21发布 2015-08-01实施 中华人民共和国农业部 ）发布 NY/T 2769—2015 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由农业部畜牧业司提出。 本标准由全国畜牧业标准化技术委员会（SAC/TC274)归口。 本标准起草单位：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所。 本标准主要起草人：邱静、陈爱亮、李爽跃、赵小阳、杨曙明、于洪侠， NY/T 2769—2015 牧草中15种生物碱的测定液相色谱一一串联质谱法 1范围 本标准规定了牧草中双氢麦角汀、麦角柯宁碱、麦角异柯宁碱、麦角克碱、麦角异克碱、麦角隐亭、麦 角异卡里碱、麦角辛、阿托品、惹卓碱、肾形千里光碱、千里光非灵、野百合碱、千里光宁和东食若碱15种 生物碱含量的液相色谱一串联质谱测定方法。 本标准方法的检出限和定量限：上述15种生物碱的检出限均为0.005mg/kg，定量限均为 0. 01 mg/ kg. 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件， GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T14699.1饲料采样 3原理 试样中的生物碱经碱性乙睛提取，基质固相分散净化后，用液相色谱一串联质谱多反应监测模式 (MRM)测定，外标法定量。 4试剂与材料 除另有说明外，在分析中使用分析纯试剂和GB/T6682中规定的一级水。 4.1乙腈：色谱纯。 4.2甲酸：色谱纯。 4.3碳酸铵。 4.4乙酸铵：色谱纯。 4.5碳酸铵溶液（200mg/L）：称取100mg碳酸铵，用水稀释至500mL，混匀备用。 4.6乙酸铵溶液（5mmol/L，含0.1%甲酸）：称取193mg乙酸铵，加人0.5mL甲酸，用水稀释至 500mL，混匀备用。 4.7碱性乙腈溶液：取200mL乙腈和200mL碳酸铵溶液（4.5），混匀备用。 4.8酸性乙腈溶液：取100mL乙腈和100mL乙酸铵溶液（4.6），混匀备用。 4.9标准品：双氢麦角汀、麦角柯宁碱、麦角异柯宁碱、麦角克碱、麦角异克碱、麦角隐亭、麦角异卡里 ≥98.0%，物质的英文名称、分子式及CAS号见附录A。 4.10标准储备液：双氢麦角汀、麦角柯宁碱、麦角异柯宁碱、麦角克碱、麦角异克碱、麦角隐亭、麦角异 卡里碱、麦角辛、阿托品、惹卓碱、肾形干里光碱、千里光非灵为干态标准品，用乙睛配制成25mg/L（麦 角异克碱、麦角异卡里碱和麦角异柯宁碱）、50mg/L（惹卓碱、肾形于里光碱和千里光非灵）、100mg/L （双氢麦角汀、麦角柯宁碱、麦角克碱、麦角隐亭、麦角辛和阿托品）的标准储备液，称取适量的野百合碱、 千里光宁和东食著碱标准品（精确到0.0001g），分别用乙睛稀释成1000mg/L的标准储备液，-18℃ 1 NY/T 2769-2015 保存，有效期6个月。 4.11混合标准溶液：分别吸取适量15种生物碱标准储备液（4.10），用乙睛稀释双氢麦角汀、麦角柯宁 碱、麦角异柯宁碱、麦角克碱、麦角异克碱、麦角隐亭、麦角异卡里碱、麦角辛、阿托品、惹卓碱、肾形千里 光碱、千里光非灵、野百合碱、千里光宁和东碱浓度均为1mg/L的混合标准溶液，一18℃保存，有 效期3个月。 4.12净化吸附剂：PSA（乙二胺-N-丙基硅烷），粒度40um。 4.13微孔滤膜：0.22um，有机相。 5仪器和设备 5.1液相色谱一串联质谱仪，配有电喷雾电离源（ESI)。 5.2分析天平，感量0.0001g。 5.3粉碎机。 5.4振荡器。 5.5离心机，最高转速≥13000r/min。 5.6氮气吹干仪。 5.7涡旋仪。 5.8超声波清洗器。 6试样制备与保存 按GB/T14699.1的规定采集牧草样品。 6.1干草样品 将干草样品用四分法缩至50g～100g，经粉碎机粉碎，全部通过0.42mm孔径筛，混匀，常温储存 备用。 6.2鲜草样品 将鲜草样品于常温通风干燥或者自然晒干制成干草样品，然后按6.1方法制备和储存。 6.3空白基质样品 取空白干草或鲜草样品，如为鲜草样品则先在70℃通风烘干，或者自然晒干制成干草样品，然后按 6.1方法制备和储存。 7分析步骤 7.1提取 称取烘干样品1g（精确到0.0001g）试样于50mL聚四氟乙烯离心管中，加入10mL碱性乙腈溶 液（4.7），振荡15min，超声提取15min，13000r/min离心20min，滤纸过滤，待净化。 7.2净化 取4mL上清液于10mL离心管中，35℃氮气吹干，准确加人1mL酸性乙腈溶液（4.8），涡旋 1min，加人50mgPSA（4.12），涡旋混合1min，5000r/min离心2min，取上清液过微孔滤膜，上机测定。 7.3基质匹配标准曲线绘制 取空白牧草样品，按上述方法处理制得其空白基质溶液，准确量取15种生物碱混合标准溶液适量， 用空白基质溶液稀释成浓度为0.004μg/mL、0.01ug/mL、0.05mg/mL、0.1mg/ml、0.2mg/mL的基 质匹配混合标准工作溶液，临用现配，供液相色谱一串联质谱测定。以上述溶液中各生物碱的浓度为横 坐标，相应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线 NY/T 2769—2015 7.4测定 7.4.1液相色谱参考条件 色谱柱：Cl8柱，长250mm，内径4.6mm，粒度5um，或相当者。 柱温：30℃。 流动相：A为乙睛，B为乙酸铵溶液（4.6），梯度洗脱条件见表1。 流速：0.3mL/min。 进样量：10μL。 表 1 流动相梯度洗脱条件 时间，min A,% B,% 0 30 70 4 70 30 6 70 30 9 90 10 10 90 10 14 70 30 15 70 30 18 30 70 26 30 70 7.4.2 质谱参考条件 电离方式：电喷雾正离子电离，十5500V。 离子源温度：450℃。 检测方式：多反应监测（MRM）。 使用前，应调节各气体流量，优化质谱参数，以使质谱灵敏度达到检测要求。 定性离子对、定量离子对、去簇电压及碰撞能的参考值见表2。 表2 215种生物碱定性离子对、定量离子对、去簇电压及碰撞能的参考值 定性离子对 定量离子对 去簇电压(DP) 碰撞能(CE) 被测物名称 m/ z m/z V eV 双氢麦角汀 612.5/270.5 48 612.5/270.5 75 (dihydroergocristine) 612.5/350.2 45 麦角柯宁碱 562.3/223.1 48 562.3/223.1 75 (ergocornine) 562.3/268.2 45 麦角异柯宁碱 562.3/223.1 48 562.3/223.1 75 (ergocorninine) 562.3/305.2 45 麦角克碱 610.3/223.1 48 610.3/223.1 70 (ergocristine) 610.3/268.2 45 麦角异克碱 610.3/223.1 48 610.3/223.1 70 (ergocristinine) 610.3/305.2 45 麦角隐亭 576.5/223.1 48 76.5/223.1 70 (ergocryptine) 576.5/268.2 45 麦角异卡里碱 576.5/223.1 48 576.5/223.1 70 (crgocryptinine) 576.5/305.2 42 麦角辛 548.3/223.1 45 548.3/223.1 70 (ergosine) 548.3/268.2 45 阿托品 290.3/93.1 43 290.3/124.2 290.3/124.2 60 (atropine) 40 3 NY/T 2769—2015 表2 (续) 定性离子对 定量离子对 去簇电压(DP) 碰撞能(CE) 被测物名称 m/ z m/ z V eV 惹卓碱 352.3/120.3 45 352.3/120.3 60 (retrorsine) 352.3/94.1 45 肾形千里光碱 366.3/150.3 40 366.3/168.1 60 (senkirkine) 366.3/168.1 40 千里光非灵 334.0/94.2 47 334.0/120.3 65 (seneciphylline) 334.0/120.3 47 野百合碱 326.2/94.1 45 326.2/120.3 60 (monocrataline) 326.2/120.3 45 千里光宁 336.1/120.1 45 336.1/120.1 60 (senecionine) 336.1/138.3 45 东若碱 304.2/121.0 30 304.2/138.0 50 (scopolamine) 304.2/138.0 32 7.4.3定性测定 在相同试验条件下，待测物在样品中的保留时间与标准工作液中的保留时间偏差在土2.5%之内， 并且色谱图中各组分定性离子对的相对丰度，与浓度接近标准工作液中相应定性离子对的相对丰度进 行比较。若偏差不超过表3规定的范围，则可判断为样品中存在对