ICS 65.120 B 25 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 2549—2014 饲料中黄曲霉毒素B的测定 免疫亲和荧光光度法 Determination of aflatoxin B, in feed- Immunoaffinity fluorescencemethod 2014-03-24发布 2014-06-01实施 中华人民共和国农业部 发布 NY/T 2549—2014 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出并归口。 本标准起草单位：中国农业科学院油料作物研究所、农业部油料及制品质量监督检验测试中心。 本标准主要起草人：李培武、张文、胡小风、丁小霞、张奇、周海燕、陈小媚、唐晓倩、张兆威、王督。 I NY/T2549—2014 饲料中黄曲霉毒素B，的测定免疫亲和荧光光度法 1范围 本标准适用于饲料及饲料原料中黄曲霉毒素B的测定。 本标准黄曲霉毒素B检出限为0.3μg/kg。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3原理 试样中黄曲霉毒素B与免疫亲和柱中固定相上抗体发生特异性结合，其他与抗体不发生免疫亲和 反应的成分随流动相流出，利用甲醇使固定相上抗体变性，将固定相上抗体结合的黄曲霉毒素B洗脱， 荧光定量检测。 4试剂 除非另有规定，仅使用分析纯试剂。 4.1水，按照GB/T6682中的要求，二级。 4.2氯化汞（HgCl2）。 4.3硫酸奎宁(C2oH26N2O,S)。 4.4甲醇(CH:OH)。 4.5浓硫酸（H2SO）。 4.7黄曲霉毒素B1荧光增强剂：准确称取2.72g氯化汞（4.2)，溶于水中，定容至1.0L。 4.81000ng/mL黄曲霉毒素B标准溶液。 4.9100ng/mL黄曲霉毒素B，标准储备液：准确吸取黄曲霉毒素标准溶液（4.8)1mL于10mL容量 瓶中，加甲醇定容。4℃可保存3个月。 警告： 由于黄曲霉毒素毒性很强，试验人员应注意自我保护。操作时，应避免吸人、接触黄曲霉毒素标准溶液。标准溶液 配置应在通风橱内进行，工作时应戴眼镜、穿工作服、戴医用乳胶手套。凡接触黄曲霉毒素的容器，需浸人10%次氯酸钠 溶液12h以上。同时，为了降低接触黄曲霉毒素的机会，本标准鼓励直接购买并使用黄曲霉毒素的有证标准储备液。 4.10黄曲霉毒素B,标准工作液：分别准确吸取黄曲霉毒素B,标准储备液（4.9)0.00mL、0.01ml、 0.05mL、0.25mL、0.50mL、1.00mL、3.00mL于10mL容量瓶中，甲醇定容，分别相当于0.0ng/mL、 0.1ng/mL、0.5ng/mL、2.5ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、30.0ng/mL浓度标准工作溶液。 4.11黄曲霉毒素B免疫亲和微柱：柱容量≥30ng，AFB免疫亲和柱与其他种类黄曲霉毒素的交叉 反应率均≤10%。 1 NY/T 2549—2014 5仪器设备 5.1黄曲霉毒素荧光速测仪或荧光光度计：能在激发波长为（360±5）nm，检测波长为（440±5）nm条 件下测定。 5.2分析天平：感量0.1g。 5.3均质机：转速大于等于20000r/min。 5.4漩涡混合器。 5.5恒温装置：(37.0±2.0)℃。 5.6微量移液器：10μuL～100μL100μL~～1000μL。 5.7中速定性滤纸。 5.8玻璃纤维滤纸。 5.9泵流操作架或固相萃取装置。 5.10分样筛：20日。 6分析步骤 6.1试样制备 样品粉碎至全部通过分样筛（5.10），充分混合。 6.2提取 准确称取25.0g试样于烧杯中，加入100.0mL甲醇溶液（4.6），用均质机（5.3）20000r/min提取 2min后，静置1min，中速定性滤纸（5.7)过滤。取10mL滤液，用20mL水稀释，漩涡混合器（5.4）混 匀，经玻璃纤维滤纸（5.8)过滤，备用。 6.3纯化 将黄曲霉毒素B免疫亲和微柱（4.11)与泵流操作架或固相萃取装置（5.9)连接，加入10.0mL纯 水平衡微柱，当微柱中仅余少量液体时，加入10.0mL稀释后的提取液（6.2），流速为1.5mL/min通过 微柱；取10.0mL水分两次淋洗，微柱中液体被抽干时，停止抽滤，弃去全部流出液。加1.0mL甲醇 cm），加人1.0mL纯水，混匀待测。 6.4标准曲线 将配制好的黄曲霉毒素B的标准工作液（4.10），在黄曲霉毒素荧光速测仪或荧光光度计（5.1）上， 激发波长360nm、检测波长440nm条件下测量本底荧光值，再加入0.2mL的荧光增强剂（4.7），再次 测量荧光值。将增强后的荧光值与本底荧光值的差值与黄曲霉毒素B标准溶液浓度建立标准曲线。 6.5黄曲霉毒素含量测定 采用黄曲霉毒素荧光速测仪或荧光光度计（5.1)在激发波长360nm、检测波长440nm条件下测定 待测液的荧光值，然后向比色杯中加人黄曲霉毒素B，荧光增强剂（4.7)0.2mL混勾后，再次测定其荧 光值，将增强后的荧光值与本底荧光值代人标准曲线，计算得到测定液中黄曲霉毒素B含量。如样品 中黄曲霉毒素B，含量超过标准曲线范围，则需稀释后再次测量。 7结果计算与表示 试样中黄曲霉毒素B，含量以质量分数X计，数值以微克每千克（ug/kg)表示，按式(1)计算。 X=pXVXn :(1) m 式中： 2 NY/T 2549-—2014 β一一从标准曲线上查得的测定液中黄曲霉毒素BI含量的数值，单位为纳克每毫升（ng/mL)； V-一样品测定液体积的数值，单位为毫升（mL)； n—一试样稀释倍数的数值； m一试样质量的数值，单位为克（g）。 计算结果保留到小数点后一位。 8 3精密度 8.1重复性 在重复性条件下，黄曲霉毒素B含量不大于10.0ug/kg时，两次独立测定结果的绝对差值不得超 过算术平均值的20%黄曲霉毒素Bl含量大于10.0μg/kg时，两次独立测定结果的绝对差值不得超过 算术平均值的15%。 8.2再现性 在再现性条件下，黄曲霉毒素B1含量不大于10.0ug/kg时，两次独立测定结果的绝对差值不得超 算术平均值的20%。 3 NY/T 2549-—2014 β一一从标准曲线上查得的测定液中黄曲霉毒素BI含量的数值，单位为纳克每毫升（ng/mL)； V-一样品测定液体积的数值，单位为毫升（mL)； n—一试样稀释倍数的数值； m一试样质量的数值，单位为克（g）。 计算结果保留到小数点后一位。 8 3精密度 8.1重复性 在重复性条件下，黄曲霉毒素B含量不大于10.0ug/kg时，两次独立测定结果的绝对差值不得超 过算术平均值的20%黄曲霉毒素Bl含量大于10.0μg/kg时，两次独立测定结果的绝对差值不得超过 算术平均值的15%。 8.2再现性 在再现性条件下，黄曲霉毒素B1含量不大于10.0ug/kg时，两次独立测定结果的绝对差值不得超 算术平均值的20%。 3 NY/T 2549-—2014 β一一从标准曲线上查得的测定液中黄曲霉毒素BI含量的数值，单位为纳克每毫升（ng/mL)； V-一样品测定液体积的数值，单位为毫升（mL)； n—一试样稀释倍数的数值； m一试样质量的数值，单位为克（g）。 计算结果保留到小数点后一位。 8 3精密度 8.1重复性 在重复性条件下，黄曲霉毒素B含量不大于10.0ug/kg时，两次独立测定结果的绝对差值不得超 过算术平均值的20%黄曲霉毒素Bl含量大于10.0μg/kg时，两次独立测定结果的绝对差值不得超过 算术平均值的15%。 8.2再现性 在再现性条件下，黄曲霉毒素B1含量不大于10.0ug/kg时，两次独立测定结果的绝对差值不得超 算术平均值的20%。 3