ICS 65.020 CCS B 16 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T2288—2021 代替NY/T2288—2012 黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫 检测与鉴定方法 Detection and Identification method of Cucumber green mottle mosaic virus 2021-05-07发布 2021-11-01实施 中华人民共和国农业农村部发布 NY/T2288—2021 全国农业食品标准 本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则 起草。 本文件代替NY/T2288—2012《黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫检测与鉴定方法》，与NY/T2288—2012 相比，除结构调整和编辑性改动外，主要技术变化如下： a）逆转录聚合酶链式反应检测法反应体系运用的引物修改为更为灵敏的CGMMV-654F/CGM MV-654R引物序列（上游引物PrimerF：5'-CGTGGTAAGCGGCATTCTAAACCTC-3'；下游 引物PrimerR:5'-CCGCAAACCAATGAGCAAACCG-3'); b) 修订了结果判定逻辑顺序，调整为典型症状初步判断，快速检测高度疑似，酶联免疫吸附测定法 和逆转录聚合酶链式反应检测法最终判定； c) 增加了档案保存章节及要求； d）修订了样品取样量的规定，区分了果实和叶片的取样量。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由农业农村部种植业管理司提出。 本文件由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)归口。 本文件起草单位：全国农业技术推广服务中心、沈阳农业大学、辽宁省绿色农业发展中心、四川省农业 农村厅植物检疫站、四川农业大学。 本文件主要起草人：王福祥、王晓亮、吴元华、夏子豪、毕馨月、蔡明、江冬、郭迪金、李小松、何珊、尚静 本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为： 2012年首次发布为NY/T2288—2012； 本次为第一次修订。 1 NY/T 2288—2021 黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫检测与鉴定方法 1范围 本文件规定了黄瓜绿斑驳花叶病毒的取样方法、检疫检测、结果判定和报告、样品处理和档案保存。 本文件适用于农业植物检疫中黄瓜绿斑驳花叶病毒的检疫检测与鉴定。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过 中的规范 生引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用 干本 反本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB15569 GB/T28071 3术语和定义 本文件没 4原理 黄瓜绿玫 green virusCe SMMV 毒属，随种子 接穗、砧木等 毒病检疫检测与鉴 重要依据是典型症状及持他 病毒双抗体夹 合型定 心酶联免疫吸 5试剂与材料 碳酸钠（N ）、碳酸氢钠(NaHCO无 水磷醉 氢钾（KH2PO）、 氯化钠(NaCI) 氧化销 aOH)、叠氮化钠 （NaN）,乙醇（C OF EPy) 离子水、市售抗体、 市售酶标抗体、市 ce式剂 配比见附录 所有试剂均为分 仪器及用具 PCR仪、台式高速冷冻离 分光光度 、酶联板 发读数仪、酶免洗板机、微量加样 器、水浴锅、电泳仪及水平电泳槽、凝胶成像系统、培养箱、冰箱 7取样 7.1种子 取样数量与方法按GB15569的规定进行，取样要充足，具有代表性。 7.2叶片及果实 随机选取发病或疑似发病叶片或果实，以幼嫩叶片和果实为主。每份果实样品不少于200g，叶片不 少于10g，装入自封袋中密封4℃保存，并注明植物名称、采集时间、地点、采集人等信息。 8检测 8.1症状检查 检查叶片、果梗、果实，与黄瓜绿斑驳花叶病毒病的典型症状进行比较（见附录B）。 1 NY/T 2288—2021 8.2快速诊断 快速诊断试纸条或诊断试剂盒检测法见附录C。如采用市售的试纸条或试剂盒，按说明操作。 8.3酶联免疫吸附测定 黄瓜绿斑驳花叶病毒酶联免疫吸附测定法见附录D。如采用市售的试剂盒，按说明操作。 8.4逆转录聚合酶链式反应检测(RT-PCR) 黄瓜绿斑驳花叶病毒逆转录聚合酶链式反应检测法（RT-PCR）见附录E。如采用市售的试剂盒，按 说明操作。 9结果判定和报告 9.1结果判定 9.1.1典型症状 果实发病且符合典型症状，可初步判定。 9.1.2快速诊断结果 快速诊断试纸条或诊断试剂盒检测结果为阳性的，可判定为高度疑似。 9.1.3酶联免疫吸附测定法 在阴性对照光密度值OD值<0.1,且阳性对照OD值大于阴性对照OD值2倍的前提下，样品孔OD 值大于阴性对照OD值2倍时，判定为阳性反应，即样品带黄瓜绿斑驳花叶病毒。 9.1.4逆转录聚合酶链式反应检测(RT-PCR) 观察电泳结果，在阳性对照在654bp处有条带出现，且空白、阴性对照无条带出现的前提下，待测样 品在654bp处有条带出现，判定为阳性反应，即样品带黄瓜绿斑驳花叶病毒。 9.1.5结果报告 将鉴定结果填人附录F的植物有害生物样本鉴定报告中。 10 样品处理 检测过程中使用的有关材料和用具，在使用完毕后须进行消毒和除害处理。经检疫鉴定后的种子样 品应保存在4℃冰箱内，叶片和果实样品应保存在一20℃以下6个月备查，保存期满后，进行灭活处理。 11档案保存 采样信息、鉴定报告等原始资料妥善保存于植物检疫机构，保存期至少一年。 NY/T 2288—2021 附录A (资料性) 试剂配制方法 A.1包被缓冲液 Na2CO：1.59g，NaHCO2.93g，NaN，0.2g，去离子水定容至1000mL，调整pH至9.64℃储存。 A.2洗涤缓冲液 Na2HPO,1.15g，KH2PO,0.2g，NaCl8.0g，KCl0.2g，吐温-200.5g去离子水定容至1000mL， 调整pH至7.4，室温储存。 A.3提取缓冲液 鸡蛋清粉2.0g，聚乙烯吡咯烷酮（PVP，K30）（分子量44000~54000）20.0g，Na2SO1.3g，NaN 0.2g，吐温-2020.0g溶解于1000mL1XPBST中，调整pH至7.4，4℃储存。 A.4酶标抗体缓冲液 牛血清蛋白2.0g，聚乙烯吡咯烷酮（PVP，K30）10.0g，NaN：0.2g，溶解于1000mL1XPBST中， 调整pH至7.4，4℃储存 A.5底物缓冲液 二乙醇胺97.0mL，MgCl²0.1gNaN30.2g，去离子水定容至800mL，调整pH至9.8，4℃储存。 NY/T 2288—2021 附录B (资料性） 黄瓜绿斑驳花叶病毒基本信息 B.1寄主范围 西瓜、葫芦、黄瓜、南瓜、瓜等瓜类作物。 B.2生物学特性 B.2.1致死温度 90 ℃~100 ℃。 B.2.2稀释限点 10-7 mL/L~10-6 mL/L。 B.2.3体外存活期 长达119d以上。在0℃可保持数年。病毒在种子内可存活240d～540d，病残体在土壤内深埋 420d,病毒仍有侵染活性。 B.2.4病毒粒体形态 电镜观察病毒粒体为棒状，长约300nm，宽15nm。 B.3典型症状 B.3. 1 西瓜染病症状 叶片出现不规则的褪绿色，呈斑驳花叶状，绿色部分隆起，叶缘向上翻卷，叶片略变窄细。果梗有时出 现褐色坏死条纹。果肉内出现条丝状黄色纤维，种子周围的果肉变暗红色水渍状，严重时果肉全变成暗红 色，内有大量空洞，软化，腐烂变味，不能食用（见图B.1和图B.2）。 图B.1西瓜果实发病典型症状 图B.2西瓜叶片发病典型症状 B.3.2甜瓜染病症状 感病后茎梢新叶出现黄斑，但随新叶老化症状减轻。成株侧枝叶出现不整形或星状黄花叶，生育后期 顶部叶片有时再现大型黄色轮斑。果实有两类症状，一种在果实表面出现绿色斑；另一种在绿色部的中心 会出现灰白色。 B.3.3黄瓜染病症状 感病初期新叶出现黄色小斑点，以后黄色部分扩展成花叶，并发生深绿瘤状突起，叶脉呈绿带状，严重 时植株顶部几张叶片边缘上卷成杯严重时植株顶部几张叶片边缘上卷成杯状。发病轻时果实只出现淡黄 4 NY/T 2288—2021 色圆形小斑点，严重时出现深绿色瘤状突起变成畸形。 B.3.4瓜染病症状 叶片出现花叶，有绿色突起，脉间黄化，叶脉呈绿带状。 B.3.5葫芦染病症状 幼叶出现淡黄色花叶，其后出现浓绿凹凸斑，随叶片老化症状减轻 B.4传播途径 B.4.1传播方法 种子传播，接触传染（植物间接触、农事操作、汁液），介体传毒（苑丝子、黄瓜叶甲等），花粉传毒，病残 体传播，以及栽培营养液、灌溉水、被污染的包装容器以及动物粪便传播等。其中，带毒种子是远距离传播 主要途径，接触传染是近距离传播主要途径。 B.4.2侵染循环 在种子、病株残体、土壤中均可越冬，成为第二年的初侵染来源。带毒种子是主要初侵染源。在田间， 能很容易地通过病株的汁液接触传播，人工嫁接和授粉等方式易再传染。因此，田间农事操作如整枝、上 架、摘心、授粉、嫁接均可导致该病毒的再次传播、 B.4.3流行与环境 发病受温度影响，在16℃时侵染至发病需2周～3周，显病较轻；在28℃～35℃下接种1周即可发 病，症状重。适生性和抗逆性极强，所有株系都是极端稳定的，常温下病毒侵染力可保持数月，在0℃可保 持数年。田间一旦发病，如未进行特殊的杀灭处理，病株残体中的病毒可存活多年，即便将病根埋在土壤 内一年以上，病毒仍有侵染能力。发病受湿度影响较大，在田间如遇连阴雨，易造成流行。