书 书 书犐犆犛 ６７ ． １２０ 犡 ０４ 　 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ２１９８１ — ２００８ 动物源食品中激素多残留检测方法 液相色谱  质谱 ／ 质谱法 犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犺狅狉犿狅狀犲犿狌犾狋犻狉犲狊犻犱狌犲狊犻狀犳狅狅犱狊狋狌犳犳狊狅犳 犪狀犻犿犪犾狅狉犻犵犻狀 — 犔犆犕犛 ／ 犕犛犿犲狋犺狅犱 ２００８  ０６  ０６ 发布 ２００８  ０７  ０３ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准附录 Ａ 和附录 Ｂ 为规范性附录 ， 附录 Ｃ 、 附录 Ｄ 、 附录 Ｅ 、 附录 Ｆ 和附录 Ｇ 均为资料性附录 。 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出 。 本标准由中华人民共和国国家认证认可监督管理委员会归口 。 本标准起草单位 ： 北京市疾病预防控制中心 、 中国疾病预防控制中心营养与食品安全所 、 中国检验 检疫科学研究院 。 本标准主要起草人 ： 邵兵 、 杨奕 、 张晶 、 吴永宁 、 储晓刚 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ２１９８１ — ２００８ 动物源食品中激素多残留检测方法 液相色谱  质谱 ／ 质谱法 １ 　 范围 本标准规定了动物源食品中激素残留量的液相色谱  质谱 ／ 质谱测定方法 。 本标准适用于猪肉 、 猪肝 、 鸡蛋 、 牛奶 、 牛肉 、 鸡肉和虾等动物源食品中 ５０ 种激素 （ 见附录 Ａ ） 残留的 确证和定量测定 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 。 凡是注日期的引用文件 ， 其随后所有 的修改单 （ 不包括勘误的内容 ） 或修订版均不适用于本标准 ， 然而 ， 鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本适用于本标准 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 （ ＧＢ ／ Ｔ６６８２ — １９９２ ， ｎｅｑＩＳＯ３６９６ ： １９８７ ） ３ 　 方法提要 试样中的目标化合物经均质 ， 酶解 ， 用甲醇  水溶液提取 ， 经固相萃取富集净化 ， 液相色谱  质谱 ／ 质 谱仪测定 ， 内标法定量 。 ４ 　 试剂和材料 除特殊注明外 ， 本标准所用试剂均为色谱纯 ， 水为 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 规定的一级水 。 ４ ． １ 　 甲醇 。 ４ ． ２ 　 二氯甲烷 。 ４ ． ３ 　 乙腈 。 ４ ． ４ 　 甲酸 。 ４ ． ５ 　 乙酸 ： 分析纯 。 ４ ． ６ 　 乙酸钠 （ ＮａＡＣ · ４Ｈ ２ Ｏ ）： 分析纯 。 ４ ． ７ 　 β  葡萄糖醛酸酶 ／ 芳香基硫酸酯酶溶液 （ β ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ ／ ａｒｙｌｓｕｌｆａｔａｓｅ ）： ４．５Ｕ ／ ｍＬ β  葡萄糖醛酸 酶 ， １４Ｕ ／ ｍＬ 芳香基硫酸酯酶 。 ４ ． ８ 　 乙酸  乙酸钠缓冲溶液 （ ｐＨ５．２ ）： 称取 ４３．０ｇ 乙酸钠 （ ＮａＡＣ · ４Ｈ ２ Ｏ ）， 加入 ２２ｍＬ 乙酸 ， 用水溶 解并定容到 １０００ｍＬ ， 用乙酸调节 ｐＨ 到 ５．２ 。 ４ ． ９ 　 甲醇  水溶液 （ １＋１ ， 体积比 ）： 取 ５０ｍＬ 甲醇和 ５０ｍＬ 水混合 。 ４ ． １０ 　 二氯甲烷  甲醇溶液 （ ７＋３ ， 体积比 ）： 取 ７０ｍＬ 二氯甲烷和 ３０ｍＬ 甲醇混合 。 ４ ． １１ 　 ０．１％ 甲酸水溶液 ： 精确量取甲酸 １ｍＬ 加水稀释至 １０００ｍＬ 。 ４ ． １２ 　 标准品 ： 去甲雄烯二酮 、 群勃龙 、 勃地酮 、 氟甲睾酮 、 诺龙 、 雄烯二酮 、 睾酮 、 普拉雄酮 、 甲睾酮 、 异睾 酮 、 表雄酮 、 康力龙 、 １７ β  羟基雄烷 ３ 酮 、 美睾酮 、 达那唑 、 美雄诺龙 、 羟甲雄烯二酮 、 美雄醇 、 雌二醇 、 雌三 醇 、 雌酮 、 炔雌醇 、 己烷雌酚 、 己烯雌酚 、 己二烯雌酚 、 炔诺酮 、 ２１ α  羟基孕酮 、 １７ α  羟基孕酮 、 左炔诺孕酮 、 甲羟孕酮 、 乙酸甲地孕酮 、 孕酮 、 甲羟孕酮乙酸酯 、 乙酸氯地孕酮 、 曲安西龙 、 醛固酮 、 泼尼松 、 可的松 、 氢 化可的松 、 泼尼松龙 、 氟米松 、 地塞米松 、 乙酸氟氢可的松 、 甲基泼尼松龙 、 倍氯米松 、 曲安奈德 、 氟轻松 、 氟米龙 、 布地奈德 、 丙酸氯倍他索 ， 纯度均大于 ９７％ 。 物质英文名称及 ＣＡＳ 号见附录 Ａ 。 １ 犌犅 ／ 犜 ２１９８１ — ２００８ ４ ． １３ 　 同位素内标 ： 炔诺孕酮 ｄ ６ 、 孕酮 ｄ ９ 、 甲地孕酮乙酸酯 ｄ ３ 、 甲羟孕酮 ｄ ３ 、 美仑孕酮 ｄ ３ 、 炔诺酮  １３ Ｃ ２ 、 氯睾酮乙酸酯 ｄ ３ 、 氯睾酮 ｄ ３ 、 １６ β  羟基司坦唑醇 ｄ ３ 、 甲睾酮 ｄ ３ 、 勃地龙 ｄ ３ 、 氢化可的松 ｄ ３ 、 睾酮  １３ Ｃ ２ 、 雌 酮 ｄ ２ 、 雌二醇  １３ Ｃ ２ 、 己烯雌酚 ｄ ６ 、 己二烯雌酚 ｄ ２ 、 己烷雌酚 ｄ ４ ， 物质英文名称见附录 Ｂ 。 ４ ． １４ 　 标准储备液 ： 分别准确称取 １０．０ｍｇ 的标准品及内标于 １０ｍＬ 容量瓶中 ， 用甲醇溶解并定容至 刻度制成 １．０ｍｇ ／ ｍＬ 标准储备液 ， －１８℃ 以下保存 ， 标准储备液在 １２ 个月内稳定 。 ４ ． １５ 　 混合内标工作液 ： 用甲醇将各标准储备溶液配制成浓度为 １００ μ ｇ ／ Ｌ 的混合内标工作液 。 ４ ． １６ 　 混合标准工作液 ： 根据需要 ， 用甲醇  水溶液 （ ４．９ ） 将各标准储备溶液配制为适当浓度 （ ０．５ ， １ ， ２ ， ５ ， １０ ， ２０ 和 ４０ μ ｇ ／ Ｌ ， 其中炔诺酮 、 表雄酮 、 布地奈德 、 １７ β  羟基雄烷 ３ 酮 、 氟米龙 、 氟甲睾酮为其他化合 物浓度的 ５ 倍 ）， 标准工作溶液中含各内标浓度为 １０ μ ｇ ／ Ｌ 。 ４ ． １７ 　 ＥＮＶＩＣａｒｂ 固相萃取柱 （ ５００ｍｇ ， ６ｍＬ ） 或相当者 ， 使用前依次用 ６ｍＬ 二氯甲烷  甲醇溶液 （ ４．１０ ）、 ６ｍＬ 甲醇 、 ６ｍＬ 水活化 。 ４ ． １８ 　 氨基固相萃取柱 （ ５００ｍｇ ， ６ｍＬ ）， 使用前用 ６ｍＬ 二氯甲烷  甲醇溶液 （ ４．１０ ） 活化 。 ５ 　 仪器 ５ ． １ 　 液相色谱  串联四极杆质谱仪 ： 配有电喷雾离子源 。 ５ ． ２ 　 电子天平 ： 感量为 ０．０００１ｇ 和 ０．０１ｇ 。 ５ ． ３ 　 组织匀浆机 。 ５ ． ４ 　 涡旋混合器 。 ５ ． ５ 　 恒温振荡器 。 ５ ． ６ 　 超声清洗仪 。 ５ ． ７ 　 离心机 ： １００００ｒ ／ ｍｉｎ 。 ５ ． ８ 　 固相萃取装置 。 ５ ． ９ 　 氮吹仪 。 ５ ． １０ 　 ｐＨ 计 。 ５ ． １１ 　 移液器 。 ６ 　 试样制备 ６ ． １ 　 动物肌肉 、 肝脏 、 虾 从所取全部样品中取出有代表性样品约 ５００ｇ ， 剔除筋膜 ， 虾去除头和壳 。 用组织捣碎机充分捣碎 均匀 ， 均分成两份 ， 分别装入洁净容器中 ， 密封 ， 并标明标记 ， 于 －１８℃ 以下冷冻存放 。 ６ ． ２ 　 牛奶 从所取全部样品中取出有代表性样品约 ５００ｇ ， 充分摇匀 ， 均分成两份 ， 分别装入洁净容器中 ， 密封 ， 并标明标记 ， 于 ０℃ ～ ４℃ 以下冷藏存放 。 ６ ． ３ 　 鸡蛋 从所取全部样品中取出有代表性样品约 ５００ｇ ， 去壳后用组织捣碎机充分搅拌均匀 ， 均分成两份 ， 分 别装入洁净容器中 ， 密封 ， 并标明标记 ， 于 ０℃ ～ ４℃ 以下冷藏存放 。 注 ： 制样操作过程中应防止样品被污染或其中的残留物发生变化 。 ７ 　 分析步骤 ７ ． １ 　 提取 称取 ５ｇ 试样 （ 精确至 ０．０１ｇ ） 于 ５０ｍＬ 具塞塑料离心管中 ， 准确加入内标溶液 （ ４．１５ ） １００ μ Ｌ 和 １０ｍＬ 乙酸  乙酸钠缓冲溶液 （ ４．８ ）， 涡旋混匀 ， 再加入 β  葡萄糖醛酸酶 ／ 芳香基硫酸酯酶溶液 １００ μ Ｌ ， 于 ３７℃±１℃ 振荡酶解 １２ｈ 。 取出冷却至室温 ， 加入 ２５ｍＬ 甲醇超声提取 ３０ｍｉｎ ， ０℃ ～ ４℃ 下 ２ 犌犅 ／ 犜 ２１９８１ — ２００８ １００００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０ｍｉｎ 。 将上清液转入洁净烧杯 ， 加水 １００ｍＬ ， 混匀后待净化 。 ７ ． ２ 　 净化 提取液 （ ７．１ ） 以 ２ｍＬ ／ ｍｉｎ ～ ３ｍＬ ／ ｍｉｎ 的速度上样于活化过的 ＥＮＶＩＣａｒｂ 固相萃取柱 （ ４．１７ ）。 将 小柱减压抽干 。 再将活化好的氨基柱串接在 ＥＮＶＩＣａｒｂ 固相萃取柱下方 。 用 ６ｍＬ 二氯甲烷  甲醇溶 液 （ ４．１０ ） 洗脱并收集洗脱液 ， 取下 ＥＮＶＩＣａｒｂ 小柱 ， 再用 ２ｍＬ 二氯甲烷  甲醇溶液 （ ４．１０ ） 洗氨基柱 ， 洗 脱液在微弱的氮气流下吹干 ， 用 １ｍＬ 甲醇  水溶液 （ ４．９ ） 溶解残渣 ， 供仪器测定 。 ８ 　 测定 ８ ． １ 　 雄激素 、 孕激素 、 皮质醇激素测定 ８ ． １ ．