ICS13.060 C51 中华人民共和国国家标准 GB/T16125—2012 代替GB/T16125—1995 大 型溞急性毒性实验方法 Methodforacutetoxicitytestofdaphniamagnastraus (ISO6341-1996Waterquality—Determinationoftheinhibition ofthemobilityofDaphniamagnaStraus(Cladocera,Crustacea)— Acutetoxicitytest,NEQ) 2012-11-20发布 2013-05-01实施 中华人民共和国卫生部 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准代替GB/T16125—1995《大型水蚤测试标准方法》,与GB/T16125—1995相比主要技术变 化如下: ———将原标准名称《大型水蚤测试标准方法》修改为《大型溞急性毒性实验方法》; ———将原标准的主题内容与适用范围修改为范围,并删除大型溞生长及繁殖实验方法(慢性效应); ———依据GB/T1.1—2009调整了结构,增补了“规范性引用文件”、“术语和定义”; ———本标准4.2增加了标准稀释水的定义和配制方法; ———本标准6.1增加了样品采集与保存方法; ———本标准7.1增加了限度实验的内容和方法; ———本标准增加了质量控制和质量保证的内容和方法; ———将原标准附录A调整为附录A“大型溞的培养繁殖方法”和附录B“斜生栅藻的培养技术”。 本标准使用重新起草参考ISO6341:1996《水质—大型溞(甲壳纲、枝角目)活动抑制的测定》编制, 与ISO6341:1996的一致性程度为非等效。 本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。 本标准起草单位:中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所。 本标准主要起草人:刘凡、潘力军、高世荣、王俊起。 ⅠGB/T16125—2012 大型溞急性毒性实验方法 1 范围 本标准规定了大型溞急性毒性实验方法。 本标准适用于评价可溶性化学物质的毒性、工业废水及固体废弃物浸出液的综合毒性、废水的处理 效果、地表水、地下水及水中沉积物的毒性。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和实验方法 GB12997 水质 采样方案设计技术规定 GB12998 水质 采样技术指导 GB12999 水质采样 样品的保存和管理技术规定 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 半数有效浓度 medianeffectiveconcentration EC50 在24h或48h内50%暴露在实验液中大型溞活动受抑制(包括死亡)的浓度。 3.2 活动抑制 immobilization 轻轻摇动实验容器,若15s之内大型溞不能游动,认为其运动能力受到抑制,即使其触角仍能活 动,也应算做活动受抑制的个体。 4 实验原理 本标准用大型溞为实验生物,将大型溞置于一系列浓度的实验溶液中,计数24h和48h大型溞活 动能力受到抑制(包括死亡)的数量,计算24h和48h半数有效浓度(24hEC50和48hEC50),判断实验 溶液的毒性程度。实验分为两个阶段:预实验和正式实验。 5 试剂和材料 5.1 一般要求 本标准所用试剂均为符合国家标准的分析纯化学试剂,实验用水要求参照GB/T6682。 1GB/T16125—2012 5.2 实验生物 大型溞(DaphniamagnaStraus)(甲壳纲,枝角亚目)62Dm纯品系生物株为实验溞种。实验用溞 取同龄同母体后代,培养1代~3代、出生6h~24h的幼蚤。实验用大型溞培养繁殖方法参见附录A。 5.3 标准稀释水 5.3.1 配制的标准稀释水pH为7.8±0.2;硬度为250mg/L±25mg/L(以CaCO3计),Ca/Mg比例 接近4∶1;溶解氧浓度在空气饱和值的80%以上;不应含有任何对大型溞有毒的物质。 5.3.2 标准稀释水用电导率小于10μS/cm的纯净水按下述方法配制: 氯化钙溶液:将11.76g氯化钙(CaCl2·2H2O)溶于水中稀释至1L; 硫酸镁溶液:将4.93g硫酸镁(MgSO4·7H2O)溶于水中稀释至1L; 碳酸氢钠溶液:将2.59g碳酸氢钠(NaHCO3)溶于水中稀释至1L; 氯化钾溶液:将0.25g氯化钾(KCl)溶于水中稀释至1L; 各取以上四种溶液25mL混合,稀释至1L。调节pH,使其稳定在7.8±0.2。标准稀释水应容许 大型溞在其中生存至少48h。 5.4 稀释水 可采用未被有毒物质污染的天然水(地面水或地下水)及自来水(自然曝气的),其pH为7.0~8.5,溶 解氧4mg/L以上,水的硬度为250mg/L±22mg/L(以CaCO3表示)。 6 仪器和设备 6.1 可采用小烧杯等玻璃制品,或者依据化合物的性质选择合适的实验容器,实验容器上加盖表面皿。 为防止玻璃容器对实验物质的吸附,实验前可用低浓度实验溶液浸泡容器(空白对照组除外)1d。 6.2 量筒、容量瓶、移液管、滴管、玻璃缸、尼龙筛网。 溶解氧测定仪、水质硬度计、pH计、温度计、电导仪、体视显微镜。 7 样品 7.1 样品的采集与保存 7.1.1 按照GB12997、GB12998、GB12999的规定。采集废水样品时,应将采样瓶充满水样,不留空 气。采集水质不稳定的工业废水,应在24h之内,每隔6h采样一次,分别测定每个样品,求得其最大 毒性。 7.1.2 样品采集后应立即进行实验。如果样品采集后6h之内不能进行实验,宜将水样冷藏保存 (0℃~4℃);超过6h,宜将水样冷冻保存(-18℃),保存时间不超过2个月。 7.2 样品的制备 7.2.1 受试物可以是可溶于水的固体、液体或气体,但要求组分一定,具有代表性、重复性。 7.2.2 易溶于水的实验物质可直接加到稀释水中,也可以溶解在蒸馏水中配成贮备液加入到稀释水中 配成实验液。贮备液应低温保存。难溶于水的物质,可使用超声波装置及其他低毒助溶剂增溶的方法, 将其溶解和分散。如果使用助溶剂,助溶剂在实验液中的浓度不应超过0.5mg/L。 7.2.3 工业废水原水样为实验原液,作为100%,用稀释水按百分数(百分率)配制成各实验浓度。 7.2.4 固体废弃物或水中沉积物。首先磨碎,按固液1∶10比例加入蒸馏水,摇匀后浸泡24h,滤纸过 滤,滤过液为被测工业固体废物或水中沉积物的浸出原液(100%),再用稀释水按百分数配制成各浓度。 2GB/T16125—2012 8 实验程序 8.1 限度实验 以受试物在实验液中的最大溶解度作为限度实验浓度(若该物质的最大溶解度大于100mg/L,则 以100mg/L作为实验浓度),实验结束时,如果大型溞的活动抑制率低于10%,则不需进行下一步实 验,否则应按照实验程序进行完整实验。 8.2 预实验 8.2.1 正式实验之前,为确定实验浓度范围,应进行预实验,除非有可参考的毒性数据。先将大型溞暴 露于范围较广的浓度系列(如0.1mg/L、1mg/L、10mg/L或1mg/L、0.1mg/L、0.01mg/L)中24h, 每个浓度至少放5个幼蚤,通过预实验找出被测物使大型溞全部存活(或无活动抑制)的浓度以及全部 死亡(或不动)的浓度,然后在此范围内设计出正式实验中各组的浓度。 8.2.2 应了解毒物的稳定性,在稀释水中是否会出现沉淀、pH等理化性质的改变,以便确定正式实验 是否需要采取流水或更换实验液及改变稀释水pH等措施。 8.3 正式实验 8.3.1 实验浓度设计。根据预实验的结果确定正式实验的浓度范围,按几何级数的浓度系列(等比级 数间距)设计5个~7个浓度。实验浓度要设计合理(等比级系数不超过2.2,如1、2、4、8、16等比级系 数为2),最高浓度处理组大型溞全部死亡(或不动),最低浓度处理组大型溞全部存活(或无活动抑制), 系列浓度中以能出现一个大型溞活动抑制率在40%~60%的浓度最为理想。 8.3.2 每个实验浓度置大型溞5个,平均每个大型溞的实验液不少于2mL。每个实验浓度设3个平 行。以不添加受试样品的实验组为空白对照组,内装与处理组相等体积的稀释水。如使用助溶剂,则应 设置溶剂空白对照组。实验前要用化学方法测定实验液的初始浓度。实验开始及结束时测定实验液的 pH、水温和溶解氧(DO)。对不稳定性实验液采用定时更换的措施,实验期间大型溞不喂食。 8.3.3 实验开始后应于24h及48h定时进行观察,记录每个容器中仍能活动的大型溞数,测定0%~ 100%大型溞活动抑制或死亡的浓度范围,并记录它们任何不正常的行为。 9 质量控制和质量保证 9.1 检查大型溞的敏感性及实验操作步骤的一致性,定期测定重铬酸钾的24hEC50,20℃时重铬酸 钾的24hEC50应在0.5mg/L~2.0mg/L之间。 9.2 对照组(包括空白对照组和溶剂对照组)大型溞的受抑制率不能超过10%。 9.3 应经检测证明受试物浓度保持于实验全过程(至少应为计划配制浓度的80%)。如果浓度偏差 >20%,应以测试浓度结果为准。 9.4 实验开始和结束时,对照和处理组的实验用液pH变化范围不超过1.5;实验前的培养温度应与 实验温度一致,实验可在18℃~22℃下进行,但同次实验温度的变化不超过±1℃。实验应在没有对 大型溞有害的气体、粉尘的大气条件下进行。实验结束时,所有对照